开发高通量筛选平台鉴定胶质母细胞瘤亚型特异性抑制剂及其协同治疗策略

本刊推荐研究人员针对胶质母细胞瘤(GBM)异质性和血脑屏障(BBB)阻碍治疗难题，开展基于细胞谱系的亚型特异性高通量筛选(HTS)研究，成功鉴定出R406与Ponatinib等Type 2 GBM选择性抑制剂，并发现R406与Tucatinib的协同效应，为GBM精准治疗提供新策略。

　　

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）作为成人中最致命的原发性恶性脑肿瘤，长期以来困扰着医学界。其治疗困境主要源于两大挑战：巨大的肿瘤异质性和血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）对药物递送效率的阻碍。尽管基于转录组分析的分子分型（如经典型、间充质型、前神经型）已有十多年历史，但自2011年以来GBM患者的生存期始终未能取得突破性改善。更令人遗憾的是，过去十年中美国食品药品监督管理局（FDA）没有批准任何针对GBM的靶向药物。这种严峻现状昭示着：开发针对特定GBM亚型的新型有效治疗策略已成为当务之急。

在这项发表于《Cell Insight》的研究中，研究团队基于前期重要发现——成年神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）和少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte Precursor Cells, OPCs）可分别作为小鼠两种不同GBM亚型（Type 1和Type 2）的细胞起源，且与人类I型和II型GBM在功能特性上高度保守——建立了一个创新的比较性高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS）平台，旨在系统识别谱系依赖的亚型特异性以及谱系非依赖性小分子抑制剂。

研究人员运用了多项关键技术方法：使用经过基因工程改造的小鼠GBM原代细胞模型（Type 1和Type 2各3株）；采用384孔板格式的细胞活力检测（CellTiter-Glo发光法测定ATP水平）；使用包含900种化合物的激酶抑制剂库进行筛选；通过Western blot验证亚型特征标志物表达；采用剂量反应实验和协同指数计算验证候选化合物。所有实验均在生理相关条件下（5%氧气，添加特定生长因子）进行。

研究结果通过多个方面得到系统呈现：

在"确认Type 1和Type 2 GBM细胞中 distinct 标志物表达和药物反应"方面，研究人员通过Western blot分析证实了亚型特征：Type 1 GBM细胞表现出更高的EGFR和Sox9表达，而Type 2 GBM细胞则显示Erbb3和Sox10水平升高。同时，他们验证了两种GBM亚型对达沙替尼（Dasatinib）的差异敏感性，Type 2细胞表现出更强的敏感性，突出了亚型特异性在激酶信号依赖方面的差异。

在"开发HTS平台"方面，研究团队基于Type 1和Type 2 GBM在EGFR和ERBB3差异表达以及对EGF和Nrg1激活信号的不同依赖这一关键特性，选择细胞活力测定作为主要读数输出。通过系统优化细胞密度、培养基体积和孵育时间等参数，最终确定使用500个细胞/孔、40μL培养基/孔、5天孵育时间的384孔板格式，建立了Z′因子大于0.53的稳健筛选体系。

在"HTS鉴定亚型特异性和常见GBM命中化合物"方面，研究团队使用激酶抑制剂库进行了基于活力的筛选。初筛结果显示：84种化合物对两种亚型均具有抑制效果，11种化合物对Type 1特异，18种对Type 2特异。经过确认筛选，最终验证了46种常见命中化合物，以及3种Type 2特异性命中化合物（波纳替尼、达沙替尼、PD0166285）。当将阈值降低至60%抑制率时，Type 2特异性命中化合物增加至7种。

在"R406和波纳替尼以剂量依赖性方式选择性抑制Type 2 GBM细胞"方面，研究人员通过购买商业可用化合物并在扩展的细胞系中进行验证，确认了R406和波纳替尼作为Type 2 GBM细胞的优先抑制剂。两种化合物在Type 2细胞（3112、775、631）中均表现出比Type 1细胞（3605、2024、1329）更强的生长抑制效果。

在"R406和Tucatinib在Type 2 GBM细胞中的协同效应"方面，研究发现R406与HER2抑制剂Tucatinib联合处理能够增强对Type 2细胞生长的抑制效果。协同指数计算显示CI值为0.557（小于1，表明协同作用）。与此形成鲜明对比的是，Type 1细胞对R406和Tucatinib单独或联合处理均表现出抵抗性，进一步凸显了Type 2细胞的亚型特异性脆弱性。

研究结论与讨论部分强调了本研究的重要意义。该研究成功利用基于细胞谱系的GBM亚型（Type 1和Type 2）和激酶抑制剂库，识别了Type 1和Type 2 GBM细胞中的亚型特异性药物敏感性。建立的稳健、基于细胞的HTS平台为在体外和体内筛选和表征Type 1和Type 2 GBM特异性抑制化合物奠定了坚实基础。

在验证的命中化合物中，R406和波纳替尼成为Type 2 GBM治疗的潜在候选药物。R406作为一种脾酪氨酸激酶（Spleen Tyrosine Kinase, SYK）抑制剂，最初是用于治疗免疫性血小板减少症（ITP）的口服前药fostamatinib的活性代谢物。有趣的是，由于Syk在Type 1和Type 2 GBM细胞间并无差异表达，研究人员推测R406的亚型特异性效应可能通过Syk非依赖性机制发挥作用。同样，波纳替尼作为一种多激酶抑制剂，最初针对BCR-ABL驱动的白血病开发，对FGFR和VEGFR驱动通路也表现出活性，这两种通路均与GBM进展相关。

特别重要的是，研究发现R406与Tucatinib在Type 2 GBM细胞中表现出协同效应，表明这种双重抑制可能是克服Type 2 GBM耐药机制的有效策略。鉴于GBM作为一种复杂表型，其根源在于多种信号通路的共存，针对各代表性信号组分的药物组合变得尤为重要。

研究人员也客观指出了研究的局限性：虽然HTS识别了几种有效的激酶抑制剂，但在患者来源异种移植模型和临床样本中的进一步验证对于确认其治疗相关性仍是必要的；此外，需要机制研究来阐明R406和波纳替尼在Type 2 GBM细胞中的下游效应；最后，基于细胞谱系的GBM分层策略覆盖了约46%的总GBM病例，研究人员期待扩展基于细胞起源的GBM亚型和细胞收集，使其更加全面以发现亚型特异性抑制化合物。

总之，这项研究为未来更大规模的HTS筛选GBM治疗剂开发的亚型特异性小分子抑制剂奠定了坚实基础，凸显了精准医学方法在GBM治疗中的潜力，为克服这种致命脑瘤的治疗困境提供了新的希望和方向。