小鼠的恶病质会削弱热量限制所带来的认知灵活性改善效果

《Brain, Behavior, and Immunity》：Cachexia in mice blunts improved cognitive flexibility induced by calorie restriction

胰腺癌相关性消耗综合征（cancer cachexia）导致小鼠认知灵活性下降，并通过操作性学习任务（FED3）和锂盐（LiCl）干预验证了动机性缺陷。体成分分析显示PDAC和CR组体重及肌肉质量显著降低，但炎症因子（GDF15、Activin A/B）水平在PDAC组更高。行为测试表明，CR组认知灵活性优于PDAC组，而LiCl剂量依赖性抑制CR组任务表现，提示癌症诱导的“病态”状态特异性削弱动机驱动。此外，焦虑相关行为未受显著影响，但存在非营养性物质摄入减少。

　　癌症患者中约有50%至80%会经历恶病质，这是一种涉及炎症、食欲减退以及肌肉和脂肪消耗的代谢综合征。此外，癌症患者常见的共病之一是认知功能障碍，临床证据表明，恶病质的发生与更严重的认知症状有关。鉴于在人类癌症患者中研究认知功能变化的困难，我们选择了一种小鼠模型来探讨胰腺癌（胰腺导管腺癌；PDAC）恶病质对认知表现的关键影响，使用了笼内操作性设备（Feeding Experimental Device version 3; FED3）和反转学习任务。我们比较了操作性反转任务的表现与两个没有癌症的对照组：自由进食组（ad libitum fed）和接受磷酸缓冲盐水（PBS）注射的假手术组（sham injected），以及限制饮食组（CR），后者用于控制恶病质小鼠因减少食物摄入和体重减轻而可能产生的影响。我们的PDAC模型重现了恶病质的主要特征，包括厌食、体重减轻、肌肉萎缩和炎症。CR组在反转任务中表现显著优于PDAC组和PBS组，实现了更多的反转和更高的颗粒获取数量。PBS组和PDAC组之间没有显著差异。这些结果表明，在癌症期间发生的体重和食欲减退，与因限制饮食而导致的体重减轻在大脑中被处理的方式不同，PDAC小鼠并未表现出与体重下降相匹配的对食物的动机增强。为了模拟PDAC组经历的不适感，我们对CR小鼠进行了LiCl注射。低剂量（150?mM）LiCl并未影响响应，然而高剂量（300?mM）LiCl显著减少了主动刺探次数和颗粒获取。这表明了由疾病引起的奖励价值下降，这一因素可能影响PDAC组在该任务中的表现。我们还通过一系列迷宫测试，进一步考察了PBS和PDAC组的探索行为和焦虑样行为。在高架迷宫、开放场和明暗箱测试中，我们没有发现组间在焦虑样行为上的显著差异，这表明在此恶病质模型中，基础焦虑水平并未升高。这些结果出现在显著升高的促恶病质因子GDF15、Activin A和Activin B的背景下，表明这些TGF-β家族肽的升高不足以在这些测试中引发行为变化。我们的研究结果提供了证据，表明在胰腺癌中，疾病状态对认知灵活性有特定的影响。

癌症的急性阶段，行为和生理反应如发热、食欲减退和疲劳是适应性的生存策略（Aubert, 1999）。这些过程被称为疾病行为，由炎症介质和免疫细胞调控，它们与大脑进行交流（Olson and Marks, 2019）。尽管在短期内有益，但慢性条件下的持续炎症可能导致长期的生理和行为变化，甚至使原本适应性的策略变得不适应，这种现象被称为认知不灵活，是执行功能障碍的一种形式。

癌症恶病质是指由于癌症引起的非自主性体重减轻，常伴随疲劳、恶心和身体虚弱（Baracos et al., 2018）。恶病质的症状可以被视为不适应性的疾病行为，例如从短期食欲减退向长期厌食的转变（Olson and Marks, 2019）。这种持续的炎症状态还带来其他后果，包括动机缺陷、情绪变化和神经认知功能下降（Fortes et al., 2024）。

在癌症研究中，关于神经认知、情绪和动机障碍的大部分文献集中在化疗或放疗治疗引起的障碍（Ahles et al., 2002；Dias-Carvalho et al., 2022；Tannock et al., 2004）。然而，有越来越多的文献表明癌症本身会对这些过程产生直接影响。例如，认知障碍影响大约30%的患者在治疗前，增加到治疗期间的约75%。多达35%的患者在治疗结束后仍经历持续的认知功能丧失（Olson and Marks, 2019）。这种对认知的影响也出现在非中枢神经系统肿瘤的情况下，周围实体肿瘤能够诱导认知功能下降（Jansen et al., 2011）。还有更多证据表明，骨骼肌丢失和认知功能障碍是相互关联的，癌症恶病质患者表现出加剧的抑郁症状（但不包括焦虑），以及生活质量的下降，即使在诊断时间和癌症严重程度得到控制的情况下（Nipp et al., 2018）。在癌症长期幸存者中，因子分析将认知功能、疲劳、失眠、疼痛、气短、食欲减退、便秘、腹泻、恶心和呕吐等症状归为一个集群。这表明恶病质的典型症状（食欲减退、恶心和呕吐、疲劳）与神经认知功能下降之间存在联系（Zucca et al., 2012），但并未区分癌症诱导和恶病质诱导对情绪和认知的影响，这可能阻碍有效的干预策略。

癌症患者中常见的异常情绪，如抑郁和焦虑，反复被识别为与转移性癌症共病（Thavarajah et al., 2012）。癌症患者中升高的焦虑水平与较差的营养状况有关，这可以作为恶病质的代理指标（Nardi et al., 2024）。在小鼠的Lewis肺腺癌（LLC）模型中，已经报告了情绪相关行为的变化，其中小鼠在开放场和高架迷宫任务中表现出减少的探索行为，以及增加的筑巢时间（Campos et al., 2017）。这可能反映了癌症和恶病质引发的多种情绪和动机变化，包括减少的运动活动和增加的疲劳，但这些结果是否更多地反映了运动功能缺陷，而非动机或认知缺陷，仍不清楚。

在恶病质期间发生认知和动机变化可以在小鼠中通过操作性（强化学习）任务和设备如FED3进行测量。FED3等笼内设备已被广泛认可为比传统操作性装置更优的替代方案，因为这些设备被放置在小鼠的笼子中，减少了实验人员的互动，从而降低了动物的压力，同时也能快速进行任务训练（Matikainen-Ankney et al., 2021）。小鼠模型有助于分离人类患者中存在的情绪和认知缺陷，从而为有针对性的干预提供信息。与癌症恶病质相关的认知方面之一是认知灵活性，这指的是在变化的环境中切换行为过程以适应的能力（Dajani and Uddin, 2015）。已有大量文献表明，癌症病史的个体在认知灵活性方面受到影响（Ahles and Root, 2018；Billiet et al., 2018；Kesler et al., 2013），但很难在人类群体中区分癌症、恶病质和癌症治疗的影响。认知灵活性的缺陷也是厌食症的标志，这是一种与恶病质有相似临床特征的严重体重减轻疾病，包括循环中的促炎细胞因子升高（如TGF-β、IL-6和IL-1β）（Solmi et al., 2015），并且认知功能下降也与较低的肌肉质量相关（Sui et al., 2021）。

癌症恶病质的小鼠模型表现出脂肪和肌肉的损失、食欲减退以及促恶病质因子的升高。多种癌症类型的模型已经存在，但最常用的是KPC胰腺癌模型。该模型是一种可植入的同源胰腺癌，最初来源于KRAS癌基因和TP53肿瘤抑制基因的基因修饰（Foley et al., 2015）。它重现了人类胰腺导管腺癌（PDAC）的主要特征（Michaelis et al., 2017），并且被广泛用于研究恶病质的病理生理学。该模型表现出升高的IL-6、IL-1β和TGF-β水平，这些是已知的促恶病质因子和系统性炎症的标志（Arneson-Wissink et al., 2024；Grossberg et al., 2020；Michaelis et al., 2017）。为了测试癌症伴恶病质对认知功能的影响，我们设计了反转学习任务，使用FED3设备来评估小鼠的认知灵活性。该任务要求小鼠适应变化的奖励条件，反映了灵活学习（Bissonette and Powell, 2012）。我们还使用了一系列迷宫测试来探索患有胰腺癌的小鼠的情绪相关行为和自然探索行为，以区分认知和情绪的潜在差异影响。我们假设，患有癌症恶病质的小鼠在灵活学习方面会表现出比减少食物摄入或体重减轻相关的缺陷更严重。

在实验方法中，我们使用了8至10周龄的C57Bl/6雄性小鼠，这些小鼠在治疗前两周从Monash动物研究平台获得。小鼠在诱导胰腺癌前有一周的适应期，饲养在12小时光照和12小时黑暗的周期中，有ad libitum的普通小鼠饲料（Specialty Feeds, Glen Forrest, Western Australia）和自来水，同时提供巢材和红色Perspex避难所。为了减少与研究人员互动相关的压力，小鼠定期被处理。在该模型中，雄性小鼠被选用，因为雌性小鼠对恶病质的易感性较低（Zhong et al., 2022），这与人类中的情况相似（Zhong and Zimmers, 2020）。

在FED3反转学习实验中，小鼠根据体重被分配到三个组，以确保每组的体重分布和变化相似。这三个组包括PBS组（假手术注射PBS）、PDAC组（胰腺导管腺癌细胞悬浮在PBS中）和CR组（限制饮食）。每组最初有八只小鼠，但由于没有肿瘤（n?=?2）或肿瘤过小（n?=?1），PDAC组中有三只小鼠被排除在分析之外。小鼠的饲养条件如上所述，除了CR组，它们在黑暗阶段开始时会收到减少的食物配给。每日的食物配给最初设定为2.7?g/小鼠，并根据前一天的体重变化进行调整，以维持小鼠体重在起始体重的90%左右。这个数值的选择有两个原因，首先它与PDAC小鼠在牺牲时通常看到的体重减轻相匹配，其次，维持90%体重是动机神经科学领域标准的程序，以鼓励小鼠的动机反应。在FED3互动开始前的几周内，小鼠被多次暴露于糖颗粒（20?mg蔗糖颗粒，Able Scientific），以减少新奇厌恶。这种方法有一些局限性，因为它不能准确模拟PDAC小鼠经历的代谢变化（Arneson-Wissink et al., 2024），但在实验的最后几天能够实现食物摄入的匹配。

为了在CR小鼠中诱导主观的不适感，它们在第10天和第11天接受低剂量LiCl（150?mM，10?ml/kg）注射。PBS和PDAC小鼠则接受盐水（10?ml/kg）注射。在第13天，LiCl剂量增加到300?mM（10?ml/kg）以模拟PDAC小鼠中日益严重的疾病状态。150?mM的剂量在我们实验中足以诱导轻微的条件性味觉厌恶（数据未显示），但不会抑制过夜禁食小鼠的食物摄入（相当于1%剂量（Lachey et al., 2005）），而300?mM剂量则会在条件性味觉偏好测试中引起强烈的味觉厌恶，并显著抑制过夜禁食小鼠的再进食（相当于2%剂量（Lachey et al., 2005））。所有注射均在反转任务测试前1小时进行。

在细胞培养部分，PDAC（KPC）细胞由Daniel Marks（美国俄勒冈健康与科学大学，波特兰）慷慨提供，最初按（Foley et al., 2015）的方法进行分离。PDAC细胞在37°C下培养在含有40?ml培养基和400?μl青霉素链霉素溶液（Gibco）的烧瓶中。培养基按照之前描述的方法制备（Michaelis et al., 2017）：88%的Rosewell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基，10%的热灭活胎牛血清（Gibco），1%的1?mM钠吡ruvate（Gibco）和1%的Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids（Gibco）。为了测试小鼠的癌伴恶病质对认知功能的影响，我们设计了反转学习任务，使用FED3设备来评估小鼠的认知灵活性。该任务要求小鼠适应变化的奖励条件，反映灵活学习（Bissonette and Powell, 2012）。我们还使用了一系列迷宫测试来探索患有胰腺癌的小鼠的情绪相关行为和自然探索行为，以区分认知和情绪的潜在差异影响。我们假设，患有癌症恶病质的小鼠在灵活学习方面会表现出比减少食物摄入或体重减轻相关的缺陷更严重。

在行为测试部分，我们对小鼠进行了三组测试：FED3训练和反转学习任务、开放场测试和高架迷宫测试。这些测试用于评估焦虑样行为和运动行为，但也可以提供关于动机和风险承担行为的信息。我们在这段时间内进行了三次互补的测试（图1A）。这一时期对应于轻度恶病质，厌食通常在第9至第10天开始。我们选择这一时期是为了确保小鼠不会因恶病质导致严重的运动能力下降，这在测试中是一个已知的干扰因素。我们没有在开放场测试中发现速度或距离的差异（p?=?0.6876，单样本t检验）（图3B、C），也没有发现小鼠在任何区域停留时间的差异（p?=?0.6876，单样本t检验）（图3D）。在光暗箱测试中，我们没有发现小鼠在光侧停留时间的差异（p?=?0.6582，单样本t检验）（图3E）。在高架迷宫测试中，我们也没有发现小鼠在开放臂停留时间的差异（p?=?0.2560，ANOVA）（图3F）。这些结果表明，胰腺癌或中期恶病质并未影响该小鼠模型中的焦虑样行为或自然探索行为。我们还评估了非食物消耗行为，以控制PDAC小鼠缺乏进食是否与其他行为表型有关。我们评估了木制圆杆和高岭土颗粒的消耗，这些是不可消化的非营养物质，可能表明强迫性行为（圆杆啃咬）或缓解不适（高岭土摄入）。在实验的最后一天，我们将高岭土或圆杆颗粒放入每个笼子中，并记录动物的消耗情况。

在讨论部分，我们使用一个会话内连续反转学习任务，结合确定性奖励条件，评估了胰腺癌小鼠适应动态环境的能力，并将其与自由进食（PBS）小鼠进行比较。所有组的小鼠在初始训练阶段（FR1 Both）都展示了对操作性学习的能力，没有在奖励获取数量上出现显著差异。虽然在连续反转学习测试阶段，完成的反转次数（反映认知灵活性）在胰腺癌小鼠和自由进食小鼠之间没有差异，但限制饮食小鼠在反转次数上显著高于其他两个组，从第7天开始出现分离。限制饮食小鼠在整个任务获得过程中展示了预期的学习曲线，而自由进食小鼠或胰腺癌小鼠则在测试开始后的第一天就表现出任务熟练度的平台期，未表现出进一步的提升。此外，行为测试电池显示，胰腺癌小鼠在反转学习中的缺乏改进并非由于运动功能受损或焦虑样行为增加。与之相符的是，胰腺癌小鼠减少了因恶心引起的自我安慰行为，表明其行为并未偏离任务执行。似乎，胰腺癌小鼠在反转学习中的障碍可能是由于疾病状态引起的对蔗糖奖励的价值下降，从而影响了正确的行为选择和适应能力。

在本文中，我们并未测试LiCl引起的不适对迷宫测试表现的影响，但其他研究已经显示，在野生型小鼠中，LiCl剂量依赖性地减少了开放场中的总距离和高架迷宫中的开放臂停留时间（Heinz et al., 2021）。这表明主观的不适感会影响自然的小鼠行为，这可能反映了减少寻求愉悦刺激的动机和增加回避行为的复杂相互作用。在双瓶选择任务中，许多癌症小鼠模型表现出减少的蔗糖偏好或摄入（Lamkin et al., 2011；Nashed et al., 2015；Norden et al., 2015；Pyter et al., 2009），并且通常被解释为抑郁的标志，尤其是在伴随强迫游泳测试中增加的不动时间的情况下。然而，强迫游泳测试在评估“抑郁样”行为的有效性现在正受到广泛质疑（Molendijk and de Kloet, 2019），并且在许多地区已不再使用。减少的蔗糖摄入也是动机下降和愉悦处理能力下降的迹象。癌症对这两种过程的影响尚不清楚，例如在卵巢癌的小鼠模型中并未观察到强迫游泳测试中的不动时间或蔗糖摄入的减少（Chen et al., 2024；Lamkin et al., 2011），但在乳腺癌小鼠中观察到了增加的焦虑样行为（Pyter et al., 2009）。然而，考虑到PDAC小鼠在训练期间与自由进食小鼠在蔗糖颗粒刺探上的速度相同，我们的结果不支持癌症恶病质对抑郁样行为有特定影响。我们还评估了圆杆啃咬和高岭土摄入，以探究是否存在“经典”的疾病行为。与我们的假设相反，我们发现PDAC小鼠的高岭土摄入显著减少，表明它们并未经历“经典”的疾病行为，而圆杆啃咬则接近显著减少。圆杆啃咬是一种被认可的由过量纹状体多巴胺引起的刻板行为（Ernst, 1967），这可能表明对摄入的动机性多巴胺功能障碍，而这种功能障碍并未反映在迷宫测试中的运动活动变化上。

炎症是行为测试中描述的变化驱动因素之一，且在该模型中观察到升高的IL-6、IL-1β和TGF-β水平（Arneson-Wissink et al., 2024；Grossberg et al., 2020；Marks et al., 2001）。我们还展示了GDF15、Activin A和Activin B的升高。这些因素在恶病质中导致肌肉萎缩，但我们的结果显示它们对迷宫测试中的行为影响不大。我们没有直接测试升高的GDF15或Activin水平是否导致了认知任务中的缺陷，但GDF15最近被牵涉到认知功能障碍中，其血浆水平与败血症和神经退行性疾病中的认知障碍相关（Chen et al., 2025；Kochlik et al., 2024），因此GDF15可能在本文描述的缺陷中发挥作用。

或许通过上述提到的测试简单评估小鼠的疾病行为并不能揭示癌症恶病质对功能结果（如认知灵活性）的细微影响。在这里，我们展示了反转学习作为一种更敏感的认知-行为范式，用于模拟癌症恶病质中的疾病状态对功能的不利影响。其他研究已经显示，癌症小鼠模型中存在认知缺陷，尽管不是特定的反转学习。在乳腺癌模型中，患有癌症的小鼠在结合新颖物体/新颖位置识别任务中表现出对新颖物体位置的互动减少，这表明它们记住熟悉物体位置的能力下降。这种缺陷发生在疾病进展的晚期或运动功能影响之前，乳腺癌通常不是一种典型的恶病质癌症，而且该研究中鼠群仅在研究结束时才出现体重减轻（Walker et al., 2018）。与啮齿动物中的证据一致，一种对食物摄入产生深远影响的疾病状态（如癌症恶病质）会改变味觉皮层对味道的反应（Stone et al., 2022）。我们在此展示，这种特定的癌症与疾病状态的相互作用导致了认知灵活性的损害。这种认知障碍可能会破坏对最佳选择行为的意识，并加强对不利选择的坚持，从而影响患者在各种神经和精神疾病中的功能结果（Luo et al., 2024；Mantonakis et al., 2024）。这些数据可能有助于改善恶病质患者的疾病管理，以提高功能结果和生活质量。