阳离子脂质体封装CRISPR-Cas13a试剂盒（CLICK）实现单细胞外囊泡中循环PD-L1 mRNA原位检测以监测免疫治疗效果

本文开发了CLICK（阳离子脂质体封装CRISPR-Cas13a系统），无需外泌体（EV）纯化或RNA提取，即可在2小时内直接检测10μL血浆中PD-L1 mRNA，检测限达103 EVs/mL。通过膜融合介导的CRISPR递送与纳米流式技术（nFCM）结合，首次在单囊泡水平解析PD-L1 mRNA（+）EV亚群异质性。临床验证表明其能准确区分免疫治疗进展（PD）与稳定（SD）患者（AUC=0.8236），为肿瘤免疫疗效监测提供了快速、精准的血浆检测新范式。

　　

Highlight

肿瘤来源的细胞外囊泡（TEVs）携带反映亲本细胞特征的mRNA，并与肿瘤进展相关（Han et al. 2023; Li et al. 2024），但TEVs中PD-L1 mRNA的丰度极低，这对灵敏、简易和小型化检测提出了挑战（Hu et al. 2018）。本研究构建了一种用于PD-L1 mRNA检测的CRISPR/Cas13a传感器，该系统由纯化的Cas13a核酸酶、靶向PD-L1 mRNA的CRISPR RNA（crRNA）以及RNA荧光报告分子组成（图2A）。在Cas13a蛋白家族中，我们选择了来自嗜热勒氏菌（LwaCas13a）的直系同源物，因其在哺乳动物系统中具有高活性和低脱靶效应（Abudayyeh et al. 2017）。通过系统优化crRNA间隔序列，我们设计出针对人PD-L1 mRNA转录本（NM_014143.4）的特异性crRNA（补充表S1）。当crRNA引导的Cas13a复合物识别目标PD-L1 mRNA时，其侧向切割活性被激活，无差别切割周围的RNA报告分子，从而产生可量化的荧光信号放大（图2B）。为了验证检测性能，我们使用体外转录（IVT）的PD-L1 mRNA进行测试。如图2C所示，随着目标浓度从100 aM增加到10 nM，荧光强度显著增强，检测限（LOD）低至86.5 aM（信噪比S/N=3），动态范围跨越5个数量级。该传感器对PD-L1 mRNA表现出高特异性，与阴性对照（NC）和非目标mRNA（如GAPDH、ACTB）相比，仅目标mRNA触发显著信号响应（图2D）。此外，Cas13a传感器在10%人血浆中保持稳定活性，证实了其在实际样本中的适用性（图2E）。

Conclusions and prospects

总之，我们开发了CLICK——一种CRISPR-Cas13a负载的脂质体系统，无需RNA提取或EV分离即可实现循环EVs中PD-L1 mRNA的原位定量。通过利用CLICK的融合效率和CRISPR-Cas13a的灵敏度，结合nFCM技术，我们在临床队列中实现了单EV水平的PD-L1 mRNA（+）亚群分析。这些谱与免疫治疗反应和疾病进展相关，为癌症患者提供了一个简化、低样本量的治疗监测平台。