抗体片段揭示视紫红质-Gi信号复合物多重构象及其功能调控机制

本研究针对G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物构象动态调控机制不明确的难题，开发了靶向Gαi和Gβ亚基的抗体片段Fab79与Fab13。通过冷冻电镜技术解析了复合物结构，发现Fab79通过抑制Gαi螺旋域（AHD）闭合阻止GTPγS诱导的解离，Fab13则刚性结合Gβ亚基。该研究为GPCR信号转导的动态调控提供了新工具和机制见解。

　　

在生命活动的精密调控中，G蛋白偶联受体（GPCR）如同细胞表面的“信号接收天线”，负责感知外界刺激并启动细胞内部的应答反应。这一庞大的膜蛋白家族与人类疾病密切相关，超过30%的临床药物以其为作用靶点。然而，GPCR与下游G蛋白形成的信号复合物具有高度动态性，其构象变化与激活机制仍是黑匣子。尤其是G蛋白α亚基的螺旋域（α-helical domain, AHD）如何运动、G蛋白解离的分子开关如何控制等问题，亟待高分辨率结构生物学工具来揭示。

为了解决这一难题，瑞士保罗谢勒研究所生物分子研究实验室的Filip Pamula、Oliver Tejero、Jonas Mühle等研究人员开展了一项突破性研究。他们聚焦于视觉信号转导中的经典模型——视紫红质（Rhodopsin）与抑制型G蛋白（G_i）复合物，尝试利用抗体片段（Fab）作为分子“抓手”捕获并稳定不同的构象状态。该研究成果正式发表在《Biophysical Journal》，为理解GPCR-G蛋白信号转导的动态过程提供了关键实验证据和新型工具。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过杂交瘤技术制备并筛选靶向视紫红质-Gα_iβγ复合物的单克隆抗体片段Fab79和Fab13；随后使用尺寸排阻色谱（SEC）验证复合物稳定性；最后采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了抗体片段与信号复合物的高分辨率三维结构（分辨率为3.5-3.8 ?）。所有实验均以牛视紫红质和人源G蛋白异三聚体（Gα_iβγ）为研究对象。

Fab79与Fab13的结合特性

研究人员发现两个Fab片段表现出截然不同的结合特性：Fab79特异性结合Gα_i亚基的AHD区域，该区域在G蛋白激活过程中会发生显著构象变化；而Fab13则结合在Gβ亚基的“顶部”表面，与Gα_i或受体无直接接触。冷冻电镜结构显示，Fab13与Gβ的结合方式与传统抗体相似，采用刚性对接模式。

Fab79抑制G蛋白解离的机制

在加入非水解型GTP类似物GTPγS的条件下，通常会导致G蛋白与受体解离。但本研究首次发现，Fab79的存在能有效阻止这一解离过程。结构分析表明，Fab79结合在AHD的开放构象上，通过空间位阻效应阻碍了AHD结构域的闭合运动——而这一运动正是GTPγS诱导Gα_i与受体解离的必要步骤。这一发现直接证明了AHD构象变化在G蛋白解离过程中的关键作用。

Fab13作为结构稳定剂的应用价值

虽然Fab13不直接影响G蛋白的激活或解离过程，但其与Gβ亚基的刚性结合为冷冻电镜研究提供了理想的结构稳定剂。在重构的复合物结构中，Fab13的加入显著提高了Gβ亚基区域的分辨率，为精确解析G蛋白βγ二聚体的构象提供了技术优势。

信号复合物的构象异质性

通过分析冷冻电镜数据，研究人员观察到视紫红质-G_i复合物存在显著的构象异质性。特别是Gα_i的AHD结构域表现出多种取向，表明该区域在信号转导过程中具有高度灵活性。Fab79的结合成功捕获了其中一种功能相关的构象状态，为理解G蛋白激活的动态过程提供了结构基础。

研究结论表明，Fab79和Fab13作为新型结合工具，能够特异性地稳定GPCR-G蛋白信号复合物的不同功能状态。Fab79通过锁定Gα_i亚基AHD的开放构象，有效阻止了GTPγS诱导的复合物解离，这直接证明了AHD闭合运动是G蛋白从受体解离的必要步骤。而Fab13与Gβ亚基的刚性结合为结构研究提供了稳定的支架。这些发现不仅深化了对GPCR信号转导机制的理解，更重要的是提供了一套可推广的研究工具——这些抗体片段可应用于其他GPCR信号复合物的研究，助力捕获以往难以观察的瞬态构象中间体。

该研究的创新性在于将抗体片段从传统的结构稳定工具提升为“构象探针”，能够特异性地干预并揭示信号转导过程中的关键构象变化。由于GPCR信号通路的异常与癌症、心血管疾病、神经精神疾病等多种重大疾病密切相关，本研究提供的工具包和机制见解将为靶向GPCR的药物研发提供新思路，特别是在设计变构调节剂和 biased agonist（偏好性激动剂）方面具有重要指导价值。