海豚源Helicobacter cetorum与人源Helicobacter pylori的比较分子特征揭示幽门螺杆菌的进化起源与致病机制分化

本文通过比较海豚源H. cetorum与人源H. pylori的分子特征，揭示前者缺乏cagPAI且VacA毒力较弱，TLR激活和炎症反应显著低于H. pylori，提示其作为共生菌或低致病性病原体的特性，并为H. pylori的进化起源（宿主跳跃发生于62.3万年前）提供了关键证据。

　　

系统发育分析

胃螺杆菌属（Helicobacter）细菌在各种哺乳动物胃中定植。通过16SrRNA基因和管家基因（atpA、efp、mutY、ppa、trpC、ureI）构建的系统发育树显示，H. cetorum、H. pylori和H. acinonychis亲缘关系最近，共同形成一个进化簇。遗传多样性分析表明，H. cetorum的管家基因多样性（Π₉₅ = 4.94–9.19%）显著高于H. pylori（Π₉₅ = 3.10–3.20%），提示H. cetorum的进化历史更为古老。vacA基因仅存在于这三个物种中，但在H. acinonychis中已高度退化，裂解为13个基因片段。

H.cetorum的电子显微镜分析

扫描和透射电子显微镜显示，四种H. cetorum分离株均为弯曲、带鞭毛的细菌，长度约1.5–3 μm，宽度约0.4 μm。细胞表面可见大量外膜囊泡（OMVs），直径约40–100 nm。与H. pylori通常形成一束极鞭毛不同，超过50%的H. cetorum细菌具有单根极鞭毛，约三分之一具有两根，其余则具有三根或四根鞭毛。负染和透射电镜证实，其鞭毛部分有鞘膜包裹，鞘膜直径约35–50 nm，而无鞘鞭毛直径约20 nm。细菌对氧化应激敏感，暴露于大气10分钟即转化为不可培养的球状体。

H.cetorum菌株表达并分泌功能性脲酶

蛋白质提取物的考马斯亮蓝染色显示，四种H. pylori菌株的蛋白谱相似，而H. cetorum的蛋白谱则与之不同，其中菌株MIT 01–5903的谱带尤为独特。Western blot使用抗脲酶B（Urease-B）抗体检测，在所有样本中均可见约60 kDa的特异性条带，表明两种细菌的脲酶表达水平相当。在添加尿素和酚红的酸化琼脂平板上，H. cetorum和H. pylori均引起红色变色，表明其脲酶分泌和活性水平相当，而H. pylori脲酶缺失突变体则无此反应。基因组分析证实，H. cetorum菌株不仅含有与H. pylori相同的7基因脲酶操纵子（编码镍辅因子脲酶），还额外拥有编码铁辅因子脲酶的ureA和ureB基因，但菌株MIT 01–5903中的这些额外基因被截短，可能已无功能。

H.cetorum对红细胞具有溶血活性

Western blot分析表明，H. cetorum表达多种毒力因子蛋白，包括鞭毛蛋白A（flagellin A）、中性粒细胞激活蛋白NapA、丝氨酸蛋白酶HtrA、γ-谷氨酰转肽酶GGT以及空泡化细胞毒素VacA。在血琼脂平板上，H. cetorum和H. pylori均表现出强烈的溶血活性，菌落周围形成透明圈，表明两者具有相似的从宿主获取铁的能力。

H.cetorum VacA诱导细胞空泡形成，与H.pylori s1/m2型菌株相似

VacA基因仅存在于H. pylori和H. cetorum中。Western blot显示，两种细菌的VacA均存在约98 kDa和88 kDa的条带，但H. cetorum还额外具有更小的片段（约85 kDa和80 kDa），提示其VacA可能经历了额外的加工处理。用四种不同VacA等位基因的H. pylori菌株（高细胞毒性的s1/m1型G27、中度细胞毒性的s1/m2型P1、罕见的s2/m1型SBA-03和无毒力的s2/m2型SBA-06）以及四种H. cetorum菌株感染人胃上皮细胞系AGS。结果显示，H. cetorum能够诱导宿主细胞空泡形成，但其强度弱于H. pylori s1/m1型菌株，而与s1/m2型菌株相似，因此将其VacA活性定义为s1/m2样（s1/m2-like）。VacA蛋白序列比对显示两者具有高度同源性。计算机3D建模预测，两者VacA单体和六聚体孔形成毒素的结构非常相似，但H. cetorum VacA的一些环状结构突出，可能更容易被蛋白酶接触。将H. cetorum的vacA基因回补至H. pylori vacA缺失突变体中，Western blot证实了异源表达，且该回补菌株能够诱导与H. cetorum野生菌相似的空泡形成。

H.cetorum未能诱导NF-κB反应和IL-8分泌

使用pNF-κB-SEAP报告基因系统和IL-8 ELISA试剂盒检测感染后的炎症反应。H. pylori感染能强烈激活转录因子NF-κB并诱导上皮细胞大量分泌IL-8。相比之下，H. cetorum感染仅能引起极其微弱（若可检测到）的NF-κB激活和IL-8分泌，表明其诱导炎症反应的能力远逊于H. pylori。

H.cetorum细菌不或仅微弱激活Toll样受体

使用表达特定TLR（TLR1/2, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TLR10）的HEK293 NF-κB报告细胞系进行分析。cagPAI阳性的H. pylori菌株能强烈激活所有受测TLR，报告基因活性相对于未感染对照升高4-22倍不等。cagPAI阴性的H. pylori菌株也能类似地激活TLR1/2、TLR2、TLR4和TLR10，但由于缺乏功能性T4SS，无法激活TLR5和TLR9。与此形成鲜明对比的是，H. cetorum完全不能被TLR4、TLR5和TLR9识别，对TLR1/2、TLR2和TLR10的激活也仅为H. pylori的一半左右（约10倍于基线）。这表明宿主细胞对H. cetorum的识别能力显著减弱。

H.cetorum不诱导宿主细胞染色体DNA双链断裂

脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析显示，感染cagPAI阳性的H. pylori会导致宿主染色体DNA发生严重断裂，这是其致癌潜力的一个关键指标。然而，感染cagPAI阴性的H. pylori或H. cetorum均未引起明显的DNA断裂，表明H. cetorum缺乏诱导宿主基因组不稳定的能力。

讨论

本研究表明，H. cetorum在进化上比H. pylori更为古老，推测H. pylori可能起源于约62.3万年前一次从海豚到早期人类的宿主跳跃事件。两者均表达高活性脲酶和溶血素，这是在其宿主胃酸环境中生存和获取铁所必需的。然而，关键区别在于H. cetorum缺乏cag致病岛（cagPAI），其VacA毒性也较弱（s1/m2样）。因此，H. cetorum仅能微弱激活有限的TLR（TLR1/2, TLR2, TLR10），几乎不引起NF-κB炎症反应、IL-8分泌或DNA损伤，其整体致病性远低于高毒力的cagPAI阳性H. pylori。这些分子特征与海豚中观察到的轻微病理表现（轻度胃炎、溃疡）相一致，支持H. cetorum在其自然宿主中更像一种共生菌或低致病性病原体，其致病性水平与人类中cagPAI阴性（II型）H. pylori菌株相当。该研究为理解H. pylori的进化起源及其强致病性的获得提供了重要的分子见解。