DICER1胚系杂合突变通过中性粒细胞胞外诱捕网非细胞自主促进肿瘤发生

本刊推荐：DICER1肿瘤易感综合征患者通常携带胚系DICER1功能缺失突变，但该突变如何促进肿瘤发生尚不明确。Larsen和Hanna团队通过构建Dicer1+/-小鼠模型，发现胚系Dicer1杂合缺失通过中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）非细胞自主性地促进横纹肌肉瘤（FN-RMS）发生。该研究揭示靶向中性粒细胞/NET释放或可降低DICER1+/-个体的癌症风险，为肿瘤预防提供新策略。

　　

在儿童肿瘤遗传易感综合征研究领域，DICER1综合征一直备受关注。这种常染色体显性遗传疾病患者通常携带胚系DICER1杂合功能缺失突变（DICER1^+/-），其患多种肿瘤的风险显著增加，包括胸膜肺母细胞瘤（PPB）、融合阴性横纹肌肉瘤（FN-RMS）等。尽管已知这些肿瘤通常伴有剩余野生型DICER1等位基因的体细胞"二次打击"突变，但胚系DICER1杂合缺失本身如何参与肿瘤发生仍是一个未解之谜。

传统观点认为DICER1作为RNA酶III核酸内切酶，通过加工前体microRNA（miRNA）形成成熟功能性miRNA，在转录后水平调控基因表达。然而，在DICER1相关肿瘤中，除了miRNA加工全局性减少外，RNase IIIb结构域的"热点"突变导致5p miRNA加工受损和3p miRNA富集，但这些变化与肿瘤发生的机制联系尚未明确。更令人困惑的是，这些热点突变并非普遍存在，提示可能存在其他机制介导胚系DICER1杂合缺失的促瘤作用。

为了解决这一科学问题，研究人员在《Developmental Cell》上发表了最新研究成果。他们通过构建基因工程小鼠模型，令人信服地证明了胚系Dicer1杂合缺失通过中性粒细胞介导的非细胞自主机制促进肿瘤发生，这一发现不仅深化了对DICER1综合征发病机制的理解，更为预防性治疗提供了潜在靶点。

研究团队主要运用了条件性基因敲除技术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、反向蛋白质阵列（RPPA）、流式细胞分选、体外功能实验、免疫荧光染色、细胞通讯分析等多种技术方法，并利用了国际胸膜肺母细胞瘤/DICER1登记处提供的人类样本进行验证。

Dicer1^+/-促进FN-RMS肿瘤形成

研究人员首先构建了模拟人类DICER1肿瘤易感遗传背景的小鼠模型，在aP2-Cre;R26SmoM2/+ FN-RMS模型（AS小鼠）中引入全球性Dicer1杂合缺失（ASD^+/-）。与ASD^+/+小鼠相比，ASD^+/-小鼠肿瘤发生更快、 penetrance更高。所有肿瘤均发生在头颈部，符合FN-RMS特征。分子分析显示ASD^+/-肿瘤中Dicer1 mRNA显著减少，成熟miRNA水平降低，但组织学和免疫组化染色显示MYOD1和DESMIN表达与ASD^+/+肿瘤相似，表明Dicer1杂合缺失功能作为单倍剂量不足的肿瘤抑制因子，促进FN-RMS肿瘤形成。

Dicer1作为非细胞自主性肿瘤抑制因子

为探究DICER1是否细胞自主性参与肿瘤发生，研究人员构建了条件性 Dicer1Flox等位基因小鼠模型。令人惊讶的是，仅在肿瘤起始细胞中条件性删除一个Dicer1拷贝（ASDFlox⁺）并不影响肿瘤发生，而纯合缺失（ASDFlox^/Flox）反而降低肿瘤penetrance。通过tdTomato报告基因和FACS分选验证，发现ASDFlox⁺肿瘤细胞中约50%的Dicer1Flox等位基因发生重组，Dicer1表达降低程度与胚系杂合缺失相似。这些结果表明ASD^+/-小鼠加速的肿瘤发生需要非细胞自主性Dicer1缺失。

反向蛋白质阵列显示ASD^+/-和ASD^+/+肿瘤蛋白质组高度相似，Ki67染色显示增殖无差异。单细胞RNA测序发现肿瘤细胞亚群比例虽有差异，但无特定群体显著富集。更重要的是，将Dicer1野生型ASP肿瘤细胞移植至 Dicer1^+/-小鼠后，肿瘤生长加速，证明Dicer1^+/-微环境足以促进FN-RMS生长，且肿瘤细胞本身不需要Dicer1缺失。

Dicer1^+/-肿瘤富含中性粒细胞和中性粒细胞祖细胞

通过FACS分选肿瘤"基质"细胞并进行基因表达谱分析，发现ASD^+/-基质中上调基因最显著富集于中性粒细胞活化、脱颗粒和中性粒细胞介导的免疫等GO术语。CIBERSORTx分析预测ASD^+/-肿瘤基质中中性粒细胞含量比ASD^+/+高近5倍。单细胞RNA测序进一步证实ASD^+/-基质中中性粒细胞和中性粒细胞祖细胞显著富集，分别增加19.6倍和48.3倍。

重新聚类分析显示ASD^+/-肿瘤中性粒细胞具有高度异质性，包含"粒细胞-单核细胞祖细胞"（GMP）、"早幼粒细胞"（ProNeu）、"前中性粒细胞"（PreNeu）、"未成熟中性粒细胞"（ImmNeu）和"成熟中性粒细胞"（MatureNeu），而ASD^+/+中的少量中性粒细胞几乎全是MatureNeu。

中性粒细胞介导Dicer1^+/-小鼠的非细胞自主性肿瘤促进

流式细胞术验证了scRNA-seq结果，发现ASD^+/-肿瘤中未成熟中性粒细胞（iNEUT）和成熟中性粒细胞（mNEUT）均显著增加，但外周血中性粒细胞计数无差异，说明富集源于招募增加而非循环中性粒细胞增多。通过抗体耗竭实验，使用抗Gr-1（α-Gr-1）抗体清除中性粒细胞后，Dicer1^+/-小鼠的肿瘤生长加速现象消失，证明中性粒细胞是非细胞自主性肿瘤促进的关键介质。

CAMP在ASD^+/-肿瘤中富集并促进FN-RMS生长

通过iTALK配体-受体分析，预测ASD^+/-肿瘤中最强的配体-受体相互作用是iNEUT和mNEUT来源的Camp通过表皮生长因子受体（Egfr）和胰岛素样生长因子1受体（Igf1r）向RMS肿瘤细胞传递信号。免疫荧光染色验证了CAMP在ASD^+/-肿瘤中的富集。体外实验表明，LL-37（CAMP的切割形式）通过EGFR和IGF1R信号促进FN-RMS细胞系（RD、Rh18、Rh36）生长。联合使用EGFR抑制剂厄洛替尼和IGF1R抑制剂林西替尼可完全阻断LL-37的促生长作用。

NETs促进Dicer1^+/-小鼠的FN-RMS

细胞因子阵列显示ASD^+/-肿瘤中强效中性粒细胞招募因子和NET启动因子C5a显著富集。ELISA验证C5a在ASD^+/-肿瘤中的增加。免疫荧光染色发现肿瘤携带ASD^+/-小鼠外周血中NETs显著增加，C5a处理可增加ASD^+/+血中NET释放。Masson三色染色显示ASD^+/-肿瘤细胞外基质（ECM）重塑显著，胶原蛋白减少。

通过引入Padi4^-/-等位基因（编码介NET释放的关键酶）或使用FDA批准的NET抑制剂双硫仑，均可显著减少FN-RMS发生和生长，证明阻断NET释放能减弱肿瘤促进。

人类DICER1^+/-肿瘤富含中性粒细胞

对国际胸膜肺母细胞瘤/DICER1登记处的人类FN-RMS样本进行RNA-seq分析，发现DICER1^+/-肿瘤中中性粒细胞相关基因（S100A8、LCN2、CXCL2、CXCL8等）显著上调。GO术语富集分析显示中性粒细胞招募和活化相关通路显著富集。CIBERSORTx分析预测DICER1^+/- FN-RMS肿瘤中中性粒细胞含量显著高于DICER1^+/+肿瘤，表明人类DICER1^+/- FN-RMS肿瘤同样呈现中性粒细胞富集表型。

本研究系统揭示了胚系Dicer1杂合缺失通过中性粒细胞和NETs非细胞自主性促进FN-RMS肿瘤发生的机制。研究发现不仅深化了对DICER1综合征发病机制的理解，更重要的是为预防性治疗提供了新思路。DICER1相关FN-RMS诊断中位年龄约为10岁，这为干预提供了"治疗窗口"，抗NET治疗可能作为预防措施降低DICER1^+/-患者发生FN-RMS的风险。

值得注意的是，虽然靶向C5a感知能减少NET释放，但遗传阻断C5a感知并不能挽救ASD^+/-小鼠的肿瘤促进，表明C5a感知是非必需的，可能冗余参与肿瘤促进性NETs的产生。此外，DICER1在识别双链RNA（dsRNA）方面与细胞质dsRNA传感器高度相似，Dicer1^+/-中性粒细胞中dsRNA积累可能启动NET释放，这一机制值得进一步研究。

该研究的临床意义在于，目前对携带胚系DICER1变异个体尚无预防性干预措施来降低癌症风险。这项工作确定了中性粒细胞作为DICER1相关肿瘤促进的介质，并为DICER1肿瘤易感个体提供了潜在的癌症预防途径。同时，这些发现可能适用于其他DICER1相关恶性肿瘤，因为中性粒细胞和NETs已被证实与多种实体瘤的进展相关。