人诱导多能干细胞来源的胎儿肝星状细胞促进肝脏类器官血管化与成熟研究

本研究针对肝脏类器官缺乏关键细胞组分而无法真实模拟早期肝发育的问题，通过建立高效的人诱导多能干细胞向胎儿肝星状细胞分化体系，构建了包含肝内胚层、内皮细胞和肝星状细胞的三系肝类器官模型，揭示了肝星状细胞通过整合素β1信号通路促进类器官血管网络形成和肝细胞成熟的重要机制，为研究人类肝脏发育和先天性肝病提供了创新平台。

　　

肝脏作为人体最重要的代谢器官，其复杂的细胞组成和精细的空间结构一直让研究人员着迷。在肝脏发育过程中，多种细胞类型之间的精密对话共同调控着器官的形成和功能建立。然而，由于研究模型的限制，科学家们对早期人类肝脏发育中细胞间通讯的理解仍然相当有限。

近年来，人类肝脏类器官（liver organoids）技术的出现为研究肝脏发育提供了强大平台。这些三维培养系统能够模拟肝脏的体内结构和细胞组成，比传统的二维细胞培养方法更具生理相关性。但是，现有的肝脏类器官仍然面临着一个关键挑战——它们无法完全重现某些重要过程，特别是血管生成（vasculogenesis），这主要是由于缺乏特定的细胞组分。

在肝脏的各种细胞类型中，肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）作为肝脏特异性的周细胞（pericytes），被认为在肝脏血管生成中可能起着关键作用。然而，由于疾病相关状态和低效的生成过程，肝星状细胞在发育研究中的应用一直受到限制。现有的hiPSC-HSCs要么表现出激活表型，要么容易自发激活，限制了它们在发育研究中的相关性。

为了解决这一研究空白，日本东京大学医学科学研究所的研究团队在《Developmental Cell》上发表了一项创新性研究，开发了一种高效生成hiPSC衍生的胎儿肝星状细胞的方法，并将这些细胞整合到自组织的、无支架的肝脏类器官中。

研究人员采用的主要技术方法包括：建立细胞因子驱动的分步诱导协议，通过单细胞转录组学分析进行细胞特征鉴定，使用无基质胶（Matrigel-free）的三系类器官组装平台，进行体外和体内功能验证实验，以及应用细胞-细胞通讯分析技术。

高度高效地从hiPSCs生成HSCs

研究团队略微修改了先前建立的从hiPSCs生成 septum transversum mesenchyme（STM）的方案，探索了从hiPSC-STM生成HSCs的条件。考虑到FGF2在肝脏特化中的重要性，研究人员假设FGF2参与STM向HSCs的分化。通过将hiPSC-STM接种在含有FGF2的改良无血清分化（SFD）培养基中，他们成功地生成了hiPSC-HSCs。

研究结果显示，hiPSC-STM表现出上调的STM特异性基因HLX和WT1表达，以及下调的多能性标志物NANOG表达。从hiPSC-STM分化4天后，qPCR显示HSC相关基因（包括CD73、PCDH7和LOX）的表达上调。与从健康人成人肝脏分离并传代两次的pHSCs相比，hiPSC-HSCs表现出显著较低的活性HSC基因（包括LOX、COL1A1和αSMA）表达水平。

进一步的研究表明，FGF2通过激活RAS/MAPK信号通路调控从hiPSC-STM向HSC的分化过程和细胞增殖。转录组分析显示hiPSC-HSCs高表达HSC基因特征，而不是间皮细胞或VSMCs的特征。流式细胞术分析显示，hiPSC-HSCs中HSC相关表面标志物（CD73、ALCAM、PDGFRβ和CD71）的阳性表达率很高，与pHSCs（P3）无显著差异。

hiPSC-HSCs的特征

通过转录组分析，研究人员发现hiPSC-HSCs的转录组谱与pHSCs非常相似，但与hiPSCs和hiPSC-STMs有显著区别。hiPSC-HSCs中前100个差异表达基因（DEGs）涉及与发育过程相关的生物学过程，包括循环系统发育、生长、血管生成、对生长因子刺激的反应和再生。

基因集富集分析（GSEA）显示，胎儿HSC基因特征在hiPSC-HSCs中显著富集，而成人HSC基因特征在pHSCs中高度富集。单细胞RNA-seq分析显示，hiPSC-HSC的单细胞转录组与胎儿人类HSCs（FS1和部分FS2）高度相似，相关性系数分析也证实hiPSC-HSC更接近FS1，而不是FS2或成人HSCs（AS）。

研究人员还发现，hiPSC-HSCs能够对TGF-β1刺激做出反应，表现出形态学改变和HSC活化相关基因（包括COL1A1、SMAD7和TIMP1）的上调。将hiPSC-HSC移植到硫代乙酰胺诱导的纤维化小鼠肝脏中后，这些细胞能够在肝实质中定位，并表现出与体内HSC特征一致的形态学特征。

hiPSC-HSCs具有显著的体外扩增能力

hiPSC-HSCs表现出巨大的增殖潜力，能够传代多次，实现约10⁵倍的扩增。PCA和相关分析表明，hiPSC-HSCs的转录组谱在扩增培养过程中得到了很好的保持。胎儿HSC相关基因和细胞周期相关基因的表达在扩增过程中得到了良好维持。

流式细胞术分析显示，hiPSC-HSCs在连续传代后仍保持同质群体，表现出表面标志物的高表达。脂滴形成和维生素A储存也得到了一致保持。与之前报道的pHSCs和hiPSC-HSCs在体外扩增会导致激活不同，研究人员生成的hiPSC-HSC中αSMA、VIM和纤连蛋白的表达得到了维持。

生成含有hiPSC-HSCs的LOs

研究团队建立了一种无基质胶的方法来生成hiPSC-LO，通过共培养hiPSC-HSC、hiPSC-HE和hiPSC-EC。将这些三种细胞类型以高密度接种在低附着培养皿中后，它们能够在一天内自发有效地组装成类器官。

研究人员比较了浸没式和气液界面（ALI）培养方法，发现ALI培养系统能有效防止hiPSC-LOs发生凋亡，并显著上调肝功能相关基因和LSEC相关基因的表达。这些结果表明hiPSC-LOs在ALI培养系统中成功重现了肝和内皮发育。

hiPSC-HSCs在体外促进LOs成熟和血管化中起关键作用

为了探索hiPSC-HSCs在类器官发育中的作用，研究人员比较了含有hiPSC-HSC的LO（hiPSC-LO）和不含hiPSC-HSCs的LO（hiPSC-LOs[△HSC]）。在ALI系统中培养9天后，在hiPSC-LOs中观察到发育良好的血管结构，而在hiPSC-LOs（△HSC）中明显缺失。

qPCR分析显示hiPSC-LO（△HSC）中肝功能基因显著下调，并且表现出ALB production、氨代谢和CYP3A4分泌能力降低。组织学差异显示，hiPSC-LO中的血管腔被肝细胞包裹，这种配置在hiPSC-LO（ΔHSC）中缺失。在hiPSC-LO中观察到CYP3A4阳性肝细胞群体，而在hiPSC-LO（△HSC）中未发现CYP3A4阳性肝细胞。

单细胞RNA-seq分析显示，类器官中的ECs与健康肝脏中分离的ECs高度相似，特别是zone 1 LSEC。免疫染色显示hiPSC-LO中形成的血管LYVE-1阳性，而在hiPSC-LO（△HSC）中缺失。透射电镜分析揭示了hiPSC-LO中明显的超微结构特征，包括具有表面微绒毛的多边形肝细胞、细胞质糖原、胆小管和肝细胞间的紧密连接。

hiPSC-HSCs对类器官发育成血管化肝组织的贡献

为了评估hiPSC-HSCs对类器官发育成肝组织的贡献，研究人员将hiPSC-LOs和hiPSC-LOs（△HSC）移植到免疫缺陷小鼠的颅窗中。移植3天后，在所有hiPSC-LOs移植部位出现了新生血管形成，而在6个移植的hiPSC-LOs（△HSC）中有2个未出现这种现象。

到第28天，hiPSC-LOs形成了多层和多分支的人类血管，穿过肝细胞簇。重要的是，移植的hiPSC-LOs中肝细胞的存活率显著超过移植的hiPSC-LOs（△HSC）。hiPSC-HSCs紧密附着在这些新形成的人类血管上，反映了天然肝组织中观察到的典型细胞分布。

研究结论与意义

这项研究在生成具有胎儿HSC特征的功能性hiPSC-HSCs方面取得了显著进展，这些细胞是深入研究肝脏发育的宝贵资源。研究人员建立的详细方案，包括特定的生长因子、培养培养基和分化时间框架，为研究人员复制这种方法提供了有价值的资源。

通过共培养hiPSC-HE、hiPSC-ECs和hiPSC-HSCs，研究团队成功在体外生成了血管化的LO。这种研究模型使研究人员能够通过研究细胞-细胞通讯来进行针对性的人类肝脏发育研究。研究不仅揭示了HSCs对肝细胞最早祖细胞的影响，还发现了它们在血管形成中不可或缺的作用，这些发现以前尚未报道。

对于hiPSC-HSCs的生成，该研究的方法基于改进的hiPSC-STM生成方案，并结合了早期胎儿肝脏发育的 insights，特别是FGF2在肝脏特化中的作用。成功从hiPSC-STM生成hiPSC-HSCs验证了关于FGF2在STM向HSCs分化中关键作用的假设。

功能血管在向组织输送营养物质、氧气和生长因子中起着至关重要的作用，有助于细胞存活和生长。因此，生成血管化LOs因其促进LOs生长和促进生成更大LOs的潜力而引起了研究人员的极大关注。肝脏HSCs与周细胞有许多相似之处，周细胞是多个器官中血管生成的重要细胞成分。研究发现hiPSC-HSC和hiPSC-EC之间的紧密接触导致LOs内的血管化，hiPSC-HSC表现出与其他器官（如大脑）中周细胞相似的功能，增强血管化并维持血管完整性。

HSCs已被证实能增强肝祖细胞分化、支持肝祖细胞自我更新和维持发育中肝脏中的造血干细胞。该研究提供了证据强调hiPSC-HSC在促进LOs内肝祖细胞成熟中的重要作用。研究发现hiPSC-HSCs通过整合素β1信号通路增强肝分化，独立于HGF和RSPO3信号。这一观察表明HSC衍生的HGF和RSPO3在胎儿肝脏发育中可能主要贡献于肝祖细胞自我更新，而不是促进肝分化。

总之，该研究解决了再生医学领域，特别是肝脏发育中的一个重要空白。hiPSC-HSC与其他肝祖细胞的组合证明了这些细胞在探索肝脏发育方面的可靠性。此外，该研究中建立的hiPSC-LOs为研究早期肝脏疾病（如先天性人类肝脏疾病）提供了机会，这些疾病使用传统方法研究具有挑战性。进一步研究以揭示控制这些相互作用的信号通路和分子线索将完善研究人员精确设计肝组织的能力。