基于CRISPR/Cas9的荧光生物传感器检测Cu/Zn SOD mRNA及其在疾病诊断中的应用研究

本研究针对Cu/Zn SOD mRNA检测技术存在的操作复杂、灵敏度低等问题，开发了一种基于CRISPR/Cas9和链置换反应（SDR）的荧光生物传感器（Cas9-sgRNA/blocker）。该方法通过靶标mRNA竞争性激活Cas9-sgRNA复合物的切割活性，实现对荧光报告分子（FQ-dsDNA）的切割，产生λex/λem=488/525 nm的荧光信号，检测限达1.40 nmol L?1，具有高特异性、操作简便等优势，成功应用于血清样本中Cu/Zn SOD mRNA的检测，为疾病相关mRNA的快速诊断提供了新策略。

　　

在生命科学与医学研究领域，信使RNA（mRNA）作为遗传信息的关键载体，其表达水平与多种疾病的发生发展密切相关。其中，铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）mRNA在细胞抗氧化防御中扮演着核心角色，通过调控Cu/Zn SOD酶的表达清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受活性氧（ROS）损伤。研究表明，Cu/Zn SOD mRNA的异常表达与癌症、高血压、炎症等疾病密切相关，因此其精准检测对疾病预防、诊断和治疗具有重要意义。然而，传统的mRNA检测方法如聚合酶链反应（PCR）和质谱技术虽灵敏度高，但存在操作复杂、仪器昂贵、易产生假阳性等问题，限制了其临床应用。近年来，CRISPR-Cas系统因其高特异性和便捷性在核酸检测领域展现出巨大潜力，但如何将其高效应用于mRNA检测仍面临挑战。

为此，研究团队在《Talanta Open》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于CRISPR/Cas9和链置换反应（SDR）的荧光生物传感器，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高灵敏、高特异性检测。该研究通过设计一种称为“Cas9-sgRNA/blocker”的探针系统，利用靶标mRNA竞争性激活Cas9核酸酶的切割活性，进而切割荧光标记的双链DNA报告分子（FQ-dsDNA），产生可定量检测的荧光信号。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先，通过原核表达系统制备并纯化了Cas9核酸酶，经SDS-PAGE验证其分子量约为160 kDa；其次，通过体外转录合成并纯化了sgRNA（97 bp）；第三，设计并优化了荧光报告分子FQ-dsDNA的结构，确保其能被Cas9-sgRNA复合物高效切割；最后，利用荧光光谱法在λ_ex/λ_em=488/525 nm下检测信号，并采用标准添加法验证了该方法在稀释100倍的胎牛血清样本中的适用性。

3.1. The detection principle of Cas9-sgRNA/blocker

研究团队阐明了Cas9-sgRNA/blocker系统的工作原理：单链引导RNA（sgRNA）由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）融合而成，其中crRNA负责序列特异性识别，tracrRNA招募Cas9核酸酶。在无靶标mRNA时，阻断链（blocker）与crRNA杂交，抑制Cas9的切割活性；当Cu/Zn SOD mRNA存在时，其通过趾端序列（toehold）竞争性置换阻断链，激活Cas9-sgRNA复合物，切割相邻的FQ-dsDNA报告分子，使荧光基团（FAM）与淬灭基团（BHQ1）分离，产生荧光信号。

3.2. Optimization of Cas9-sgRNA/blocker cleavage assays

通过系统优化实验条件，研究团队发现Tris-HCl缓冲液最有利于Cas9切割反应；在四种不同互补碱基数的dsDNA底物中，含4个互补碱基的L4底物被完全切割，效果最佳；Cas9蛋白浓度在1.2 mg mL^?1时信号达到饱和；切割反应在60分钟内完成。这些优化确保了检测系统的高效性和稳定性。

3.3. Specific detection of Cu/Zn SOD mRNA

荧光检测结果表明，该传感器对Cu/Zn SOD mRNA的检测线性范围为5–50 nmol L^?1，线性方程为F=5504C_{Cu/Zn SOD mRNA}+141985（R²=0.9950），检测限低至1.40 nmol L^?1。选择性实验显示，单碱基错配链（MT-1、MT-2）和双碱基错配链（MT-3、MT-4）的荧光信号显著低于完全匹配链，且其他常见RNA（如miR-17、miR-10b、Mn SOD mRNA、Fe SOD mRNA）均未产生明显干扰，证明该方法具有优异的选择性。在血清样本检测中，加标回收率在97%–109%之间，相对标准偏差（RSD）低于2.0%，验证了其在复杂生物基质中的可靠性。

4. Conclusion

该研究成功构建了一种基于链置换反应和CRISPR/Cas9的荧光生物传感器，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高灵敏、高特异性检测。该方法不仅操作简便、成本较低，而且抗干扰能力强，适用于血清等真实样本的分析。尽管当前灵敏度在血液和细胞样本检测中仍有提升空间，但通过未来信号放大策略的优化，这一技术有望在疾病诊断、抗氧化机制研究和临床检测领域发挥重要作用。该研究为mRNA检测提供了新思路，推动了CRISPR技术在分子诊断中的应用前景。