基于CRISPR/Cas9-sgRNA/blocker系统的Cu/Zn SOD mRNA荧光生物传感器开发及其在氧化应激监测中的应用

本研究针对Cu/Zn SOD mRNA检测中传统方法操作复杂、灵敏度不足的问题，开发了一种基于CRISPR/Cas9和链置换反应(SDR)的新型荧光生物传感器。该系统通过设计特异性blocker链实现靶标激活机制，成功实现了1.40 nmol L-1的高灵敏度检测，并展现出优异的特异性，为氧化应激相关疾病的早期诊断提供了新的技术平台。

　　

在细胞对抗氧化应激的防御机制中，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）发挥着至关重要的作用。其中铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）作为最常见的亚型，其mRNA表达水平与多种人类疾病包括癌症、高血压和炎症等密切相关。然而，传统的mRNA检测方法如聚合酶链反应（PCR）和质谱技术虽然灵敏，但存在操作复杂、设备昂贵且容易产生假阳性结果等问题，这严重限制了其在临床诊断中的应用。

为了解决这一技术瓶颈，来自沈阳医学院公共卫生学院的研究团队在《Sustainable Futures》上发表了一项创新性研究，他们成功开发了一种基于CRISPR/Cas9系统的荧光生物传感器，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高灵敏度和高特异性检测。

研究人员采用的主要技术方法包括：蛋白质表达纯化技术（获得高纯度的Cas9核酸酶）、体外转录技术（合成sgRNA）、荧光共振能量转移（FRET）技术（构建FAM/BHQ1标记的FQ-dsDNA荧光报告系统），以及基于链置换反应（SDR）的分子识别机制。在真实样本验证方面，研究采用了胎牛血清样本进行方法可靠性评估。

研究结果方面，首先在"检测原理"部分，研究团队巧妙设计了Cas9-sgRNA/blocker系统的工作机制：在无靶标mRNA时，blocker链与crRNA结合抑制Cas9活性；当靶标Cu/Zn SOD mRNA存在时，通过toehold介导的链置换反应释放blocker，激活Cas9对荧光报告分子的切割能力。

在"Cas9-sgRNA/blocker切割测定的优化"部分，研究人员通过系统优化确定了最佳实验条件：使用Tris-HCl缓冲体系，选择含有4个互补碱基的L4 dsDNA底物作为荧光报告分子，Cas9蛋白最佳浓度为1.2 mg mL^-1，最佳反应时间为60分钟。这些优化条件为后续的高灵敏度检测奠定了基础。

在"Cu/Zn SOD mRNA的特异性检测"部分，该方法展现出卓越的检测性能：在5-50 nmol L^-1浓度范围内呈现良好的线性关系，检测限低至1.40 nmol L^-1。更重要的是，该系统能够有效区分单碱基错配（MT-1, MT-2）和双碱基错配（MT-3, MT-4）序列，并对miR-17、miR-10b、Mn SOD mRNA和Fe SOD mRNA等共存RNA分子表现出高度特异性。在胎牛血清样本中的加标回收实验进一步证实了该方法在实际样本中的可靠性，回收率在97%-109%之间，相对标准偏差（RSD）小于2.0%。

研究结论表明，基于toehold介导的链置换反应开发的Cas9-sgRNA/blocker荧光生物传感器成功实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高选择性检测。该系统通过巧妙的分子设计，将CRISPR/Cas9系统的特异识别能力与荧光信号输出相结合，为mRNA检测提供了新的技术平台。虽然目前对实际血液和细胞样本的检测灵敏度仍有提升空间，但通过进一步的信号放大策略优化，该方法在疾病预防、诊断和治疗监测领域具有重要的应用前景，特别是在氧化应激相关疾病的早期诊断方面展现出巨大潜力。

这项研究不仅为Cu/Zn SOD mRNA检测提供了新的技术手段，也为CRISPR技术在分子诊断领域的应用拓展了新的方向，体现了多学科交叉融合在解决生物医学检测难题中的创新价值。