基于CRISPR/Cas9的Cu/Zn SOD mRNA荧光传感新策略及其在疾病标志物检测中的应用

本研究针对Cu/Zn SOD mRNA检测技术存在的操作复杂、灵敏度不足等问题，开发了一种基于CRISPR/Cas9和链置换反应（SDR）的荧光生物传感器（Cas9-sgRNA/blocker）。该系统通过靶标mRNA触发的Cas9酶活性恢复机制，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高特异性检测（LOD=1.40 nmol L?1），并在血清样本中验证了其可靠性，为疾病相关mRNA检测提供了新思路。

　　

在生命科学和医学研究领域，信使RNA（mRNA）作为遗传信息的关键载体，其表达水平与多种疾病的发生发展密切相关。其中，铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）mRNA通过调控抗氧化酶的表达，在细胞抵御活性氧（ROS）毒性中发挥核心作用。研究表明，Cu/Zn SOD mRNA的表达异常与癌症、高血压、炎症等疾病存在显著关联，因此其精准检测对疾病预防、诊断和治疗具有重要意义。然而，传统的mRNA检测方法如聚合酶链反应（PCR）和高通量测序技术虽广泛应用，但仍面临操作复杂、仪器要求高、易产生假阳性等局限。尤其是对于低丰度mRNA的检测，现有技术的灵敏度和特异性仍难以满足实际需求。

为解决这一问题，研究人员开始探索基于CRISPR-Cas系统的新型检测技术。CRISPR-Cas系统源自细菌和古菌的适应性免疫机制，通过RNA引导的Cas核酸酶实现序列特异性识别与切割，已被广泛应用于基因组编辑和分子诊断。然而，将其用于mRNA检测时，仍存在背景信号高、灵敏度不足等挑战。针对这些瓶颈，本研究开发了一种基于Cas9-sgRNA/blocker的荧光生物传感器，通过巧妙的链置换反应（SDR）设计，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高效、特异检测。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先通过原核表达系统制备并纯化了Cas9核酸酶（160 kDa），经SDS-PAGE验证纯度；其次通过体外转录合成sgRNA（97 bp），并设计含趾状结构（toehold）的阻断链（blocker）与sgRNA杂交形成复合物；最后构建了荧光淬灭双链DNA（FQ-dsDNA）报告系统，其中一条链5′端标记FAM荧光基团，另一条链3′端标记BHQ1淬灭基团。检测体系在Tris-HCl缓冲液中优化反应条件，并通过荧光光谱（λ_ex/λ_em=488/525 nm）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析切割效率。实际样本检测采用稀释100倍的胎牛血清进行加标回收实验。

3.1. The detection principle of Cas9-sgRNA/blocker

该系统设计核心在于利用sgRNA中的crRNA序列与阻断链杂交，从而抑制Cas9酶活性。当靶标Cu/Zn SOD mRNA存在时，其通过趾状介导的竞争置换反应与阻断链结合，释放出具有活性的Cas9-sgRNA复合物，进而切割相邻的FQ-dsDNA报告分子，导致荧光信号恢复。该机制实现了荧光强度与mRNA浓度的线性相关（R²=0.9950），为定量检测奠定基础。

3.2. Optimization of Cas9-sgRNA/blocker cleavage assays

通过系统优化，确定Tris-HCl为最佳反应缓冲液（荧光信号最强）；筛选出含4个互补碱基的L4 dsDNA为最适报告底物（PAGE显示完全切割）；Cas9浓度在1.2 mg mL?1时达到饱和（荧光强度最大化）；反应时间60分钟可实现底物完全切割（荧光信号平台期）。这些优化显著提升了检测效率。

3.3. Specific detection of Cu/Zn SOD mRNA

该传感器对Cu/Zn SOD mRNA的检测线性范围为5-50 nmol L?1，检测限达1.40 nmol L?1，灵敏度与现有荧光探针相当。选择性实验表明：单碱基错配链（MT-1、MT-2）和双碱基错配链（MT-3、MT-4）的荧光响应显著低于完全匹配靶标；其他共存RNA（如miR-17、miR-10b、Mn SOD mRNA、Fe SOD mRNA）均未产生明显干扰。在血清样本中，加标回收率为97%-109%，相对标准偏差（RSD）低于2.0%，证实了方法的准确性与可靠性。

本研究成功构建了一种基于CRISPR/Cas9和链置换反应的荧光传感器，实现了对Cu/Zn SOD mRNA的高灵敏、高特异性检测。该技术通过创新性的"阻断-激活"机制克服了传统Cas9系统背景信号高的问题，且无需复杂仪器或扩增步骤。在血清样本中的成功应用证明了其临床转化潜力，为疾病相关mRNA的检测提供了新工具。未来通过信号放大策略优化灵敏度后，有望在疾病早期诊断和动态监测中发挥重要作用。论文发表于《Sustainable Futures》，体现了可持续技术开发在健康医学领域的交叉应用价值。