利用Achromobacter denitrificans ISO16菌株，将柑橘皮重新利用以生产具有强催化活性的漆酶

《Results in Chemistry》：Repurposing mandarin peels for catalytically robust laccase production using Achromobacter denitrificans ISO16

柑橘皮作为生物可降解原料，通过响应面法优化培养条件，发现pH 5、柑橘皮浓度12.5 g/L、搅拌速度100 rpm、硝酸铵1 g/L时漆酶活性达136 U/mL，其分泌的漆酶具有极端pH、温度、盐及表面活性剂耐受性，可高效降解0.2%浓度合成染料并实现牛仔布单环生物漂白。

　　### 中文解读

#### 研究背景与意义

随着全球对可持续和环保工业过程的需求不断上升，越来越多的研究开始关注如何将废弃物转化为有价值的资源。在这一背景下，柑橘类水果的副产品——橙子皮，因其富含多糖、多酚和其他关键营养成分，被视作一种极具潜力的生物资源。然而，目前橙子皮的利用程度仍然较低，许多地区将其视为废弃物，导致环境污染问题日益严重。因此，探索如何高效利用橙子皮作为微生物发酵的原料，成为推动循环经济和绿色技术的重要课题。

本研究聚焦于利用橙子皮作为碳源，通过统计学优化方法，促进一种名为 *Achromobacter denitrificans* ISO16 的细菌产生具有催化活性的漆酶（laccase）。漆酶是一类多铜氧化酶，能够催化酚类和非酚类底物的氧化反应，仅需大气中的氧气，产物为水，因此在工业应用中具有高度的环境友好性。在纺织工业中，漆酶已被视为一种比化学氧化剂更环保的替代品，尤其在牛仔布漂白过程中表现突出。然而，当前漆酶的生产成本较高，主要受限于昂贵且不可持续的培养基使用，这限制了其在实际工业中的广泛应用。

此外，漆酶在实际应用中常面临环境和化学极端条件的挑战，例如高温、高盐、强酸或强碱环境，这些都会降低其催化效率。因此，如何提高漆酶的稳定性、耐受性以及可重复使用性，成为推动其工业化应用的关键。本研究通过优化培养基成分和发酵条件，探索了 *A. denitrificans* ISO16 在橙子皮培养基中产生高活性漆酶的潜力，并对其耐受性进行了系统评估。研究结果不仅为漆酶的低成本生产提供了新的思路，也为橙子皮的资源化利用提供了理论依据和实践参考。

#### 研究方法与过程

为了实现漆酶的高效生产，研究团队首先从南非半干旱地区的根际土壤中分离出 *A. denitrificans* ISO16 菌株，并通过筛选和优化培养基成分，确定其在特定条件下能够高效分泌漆酶。通过采用传统的“单变量一次”（One Variable at a Time, OVAT）方法，研究人员初步评估了pH值、温度、碳源、氮源、诱导剂和搅拌速度等因素对漆酶产量的影响。随后，利用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）对关键变量进行了更深入的统计优化，以获得更精确的实验条件。

在实验设计中，研究团队选择了包括NH?NO?（无机氮源）、橙子皮（碳源）、pH值和搅拌速度在内的关键因素，并采用中心组合设计（Central Composite Design, CCD）进行实验。最终确定的最优条件为：NH?NO? 浓度为1 g/L，橙子皮浓度为12.5 g/L，pH值为5，搅拌速度为100 rpm。在这些条件下，*A. denitrificans* ISO16 菌株分泌的漆酶活性达到了136 U/mL，显示出较高的生产效率。

在漆酶的生化特性分析中，研究人员对其最适温度、最适pH值、耐受性以及底物特异性进行了评估。结果显示，ISO16 漆酶在pH 7和70°C下表现出最佳活性，并且在广泛的pH和温度范围内保持较高的稳定性。此外，该漆酶对多种离子、表面活性剂和溶剂具有良好的耐受性，例如Mn2?、Cu2?和SDS等，这表明其在复杂工业环境中的应用潜力。在底物特异性方面，ISO16 漆酶对ABTS（2,2-联氮-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）表现出较高的催化效率，显示出其在氧化反应中的优异性能。

为了进一步提高漆酶的稳定性和可重复使用性，研究人员还进行了漆酶的固定化研究。通过使用海藻酸钠、明胶和聚乙二醇（PEG）作为固定化基质，研究人员成功实现了漆酶的固定，并在连续的8个循环中保持了83%的残余活性。这一结果表明，固定化不仅有助于漆酶的稳定，还为工业规模化应用提供了可能。

#### 研究成果与应用潜力

本研究的成果不仅在于漆酶的高效生产，还在于其在实际应用中的表现。ISO16 漆酶能够有效降解高达0.2%的合成染料（2 g/L），在80小时的反应时间内，对不同染料的脱色能力表现出显著差异。例如，对CR（ Congo Red）的脱色率高达79.96%，而对BB（Brilliant Blue）和RB（Reactive Blue）的脱色率则相对较低。这一结果表明，ISO16 漆酶在处理某些类型的合成染料方面具有显著优势，同时也能在不依赖外源氧化剂的情况下，实现对牛仔布的生物漂白。

在牛仔布生物漂白实验中，研究人员观察到，单独使用ISO16 漆酶（E）或与氧化剂ABTS结合使用（E+M）都能有效改善牛仔布的颜色和光泽。其中，E+M处理的牛仔布在6小时内呈现出更明亮的色泽，并且在加入三氯乙酸（TCA）后，其颜色从无色变为绿色，最终转变为靛蓝。这一过程表明，漆酶能够通过氧化作用激活ABTS，进而与牛仔布中的靛蓝发生电子转移反应，实现其脱色和漂白。而单独使用漆酶的处理虽然也能改善牛仔布的颜色，但效果不如与ABTS结合使用。这说明漆酶在某些情况下需要与氧化剂协同作用，才能实现最佳的漂白效果。

此外，研究人员还提出了一个可能的脱色路径，表明ISO16 漆酶能够将靛蓝转化为脱氢靛蓝（reddish or orange brown），再进一步分解为靛嗪（indole-2,3-dione）和邻氨基苯甲酸（anthranilic acid）。这一脱色过程不仅有助于减少染料对环境的污染，还为废水处理提供了新的思路。然而，单独使用漆酶的脱色效果在短时间内可能受限于其催化效率，因此可能需要额外的氧化剂或更长时间的反应来提高脱色完成度。

#### 研究结论与展望

综上所述，本研究通过优化培养基和发酵条件，成功实现了 *A. denitrificans* ISO16 漆酶的高效生产，并对其在工业应用中的性能进行了系统评估。研究发现，ISO16 漆酶不仅具有高催化活性，还表现出对多种极端环境条件的良好耐受性，这使其在环保和工业应用中具有广阔前景。此外，通过固定化技术，研究人员提高了漆酶的稳定性与重复使用性，为其在大规模工业中的应用提供了可能。

然而，尽管ISO16 漆酶在实验室条件下表现出优异的性能，但在实际应用中仍需克服一些挑战。例如，如何在工业环境中维持其高活性和稳定性，如何优化固定化工艺以提高其重复使用效率，以及如何在实际废水处理中进一步提高脱色效率。此外，研究团队还建议进一步探索该菌株在其他酶类生产中的潜力，以及如何通过基因工程手段提高其催化能力。

未来的研究可以围绕以下几个方面展开：首先，对ISO16 漆酶的基因组进行深入分析，以确定其多态性基因的来源及其在不同环境条件下的表达调控机制；其次，探索不同固定化材料对漆酶性能的影响，以找到最适合工业应用的固定化方案；最后，结合其他酶类或微生物，开发更加高效的生物处理系统，以应对复杂的工业废水处理需求。这些研究将有助于推动漆酶在环保和工业领域的广泛应用，并为可持续发展提供有力支持。