蛋白激酶A通过磷酸化Raf激酶抑制蛋白的高能构象态揭示激酶识别新机制

本研究发现蛋白激酶A（PKA）通过识别Raf激酶抑制蛋白（RKIP）的构象高能态实现磷酸化。采用NMR光谱与分子动力学模拟（RARMD）技术，揭示了RKIP通过C端螺旋解离暴露磷酸化位点的动态机制，为完整折叠蛋白的激酶识别提供了全新范式。

　　

亮点

RKIP存在基态与构象高能态

我们最初尝试利用NMR化学位移约束和X射线结构作为起始构象进行PKA-C与RKIP的分子对接，但得到了高能复合物。值得注意的是，RKIP的构象阻止了激酶接触其磷酸化所需的识别序列。因此我们提出假设：RKIP可能采用更兼容激酶结合的替代构象态。为验证这一假设，我们通过CPMG弛豫分散和CEST实验探测了RKIP的构象动力学。CPMG数据显示RKIP在毫秒时间尺度上存在构象交换（图1A）。通过全局拟合CPMG数据（图1B），我们确定了主要态（占比94%，标记为状态A）和次要态（占比6%，状态B）之间的交换过程，交换速率k_ex = 1400 ± 200 s^-1。CEST实验进一步证实了这种交换，并揭示了涉及多个残基的构象平衡（图1C）。这些残基主要位于RKIP的C端区域（αE螺旋和相邻环区），包括磷酸化位点Ser51（图1D）。值得注意的是，状态B的化学位移与完全折叠的RKIP状态显著不同，表明该状态具有部分解折叠特征。

通过 replica-averaged MD 模拟解析 RKIP 的构象集合

为在原子层面解析RKIP的构象景观，我们采用replica-averaged化学位移约束分子动力学（RARMD）模拟，将NMR实验测得的化学位移转化为结构约束。通过基于人工神经网络的NapShift方法处理¹⁵N、¹³C和¹H的化学位移，我们生成了RKIP的结构系综（图2A）。该系综显示αE螺旋存在两种主要构象：一种与X射线晶体结构一致的紧凑态（状态A），另一种则是αE螺旋从蛋白核心解离的开放态（状态B）（图2B）。构象B不仅暴露了包含Ser51的磷酸化环，还显示出部分解折叠的特征（图2C），这与NMR弛豫数据高度一致。通过马尔可夫状态模型分析MD轨迹，我们量化了状态A与状态B之间的转换能垒为~4 k_BT（图2D），表明该构象变化在生理条件下是可实现的。

PKA-C 与 RKIP 高能态的结合

接下来我们探究PKA-C如何与RKIP的短暂存在的高能态（状态B）结合。将RARMD模拟得到的RKIP构象系综与PKA-C的晶体结构进行分子对接，结果显示PKA-C优先与RKIP的开放构象（状态B）结合（图3A）。在该复合物中，RKIP的磷酸化环（残基46-51）呈现延伸构象，完美契合PKA-C的底物结合裂隙（图3B）。关键的，Ser51的侧链定向朝向PKA-C的活性位点，其羟基与ATP的γ磷酸盐距离适中，利于磷酸化反应（图3C）。结合后界面形成互补的静电与疏水相互作用网络，包括RKIP的Glu49与PKA-C的Arg133之间形成盐桥（图3D）。这些发现表明PKA通过"构象选择"机制识别并磷酸化RKIP的高能态。

讨论

RKIP的变形特性曾由Skinner等人提出，他们认为RKIP的动态特性对其功能至关重要[37]。我们的NMR数据和MD模拟证实了RKIP的动态本质。更重要的是，它们表明RKIP的C端αE螺旋在与RKIP核心相互作用的紧凑构象和分离的部分解折叠构象之间振荡。后者是PKA-C识别和磷酸化所必需的构象。这种构象平衡使RKIP能够作为多种信号通路（包括Raf/MEK/ERK和GPCR/cAMP/PKA通路）的稳态调节器。