乌毛蕨科植物酚类化合物的分布与新型木脂素blechnic acid B的结构解析及其系统发育意义

本综述系统解析了乌毛蕨科（Blechnaceae）32种蕨类植物中酚类化合物的分布特征，重点揭示了咖啡酰-5-O-奎尼酸（5-CQA）和迷迭香酸（RA）的系统发育分布规律，并首次从Neoblechnum brasiliense中分离鉴定出新型木脂素blechnic acid B（BAB）。研究通过LC/ESI-MS/MS和NMR技术明确了BAB的立体结构，并提出其可能通过dirigent蛋白介导的氧化偶联途径生物合成。该发现为蕨类植物次生代谢进化提供了化学分类学证据，并对探索天然产物的药用价值具有重要意义。

　　

引言

乌毛蕨科（Blechnaceae）为水龙骨目（Polypodiales）的薄囊蕨类植物，全球分布约200-250种，主要集中于新热带区和澳大拉西亚/大洋洲地区。现代分子系统学将其划分为3亚科24属，其中Blechnoideae亚科包含超级枝A（superclade A）和超级枝B（superclade B）两大演化支。蕨类植物富含黄酮、萜类、甾体和多酚等特化代谢产物，乌毛蕨科植物在传统中医药、印度传统医学及智利传统医学中广泛应用于皮肤疾病、泌尿感染、肺部疾病和胃肠道紊乱的治疗。

迷迭香酸（rosmarinic acid, RA）作为咖啡酸与（R）-3,4-二羟基苯乳酸的酯类化合物，最初从唇形科植物迷迭香中发现，主要分布于紫草科和唇形科 Nepetoideae 亚科。此外，RA亦存在于角苔纲植物（如Anthoceros agrestis）、金粟兰科（如Sarcandra glabra）以及多种单子叶和双子叶植物中。在蕨类植物中，RA曾报道见于Neoblechnum brasiliense（原Blechnum brasiliense）、铁线蕨（Adiantum capillus-veneris）、满江红（Azolla filiculoides）及食用蕨菜（Diplazium esculentum）。

咖啡酰-5-O-奎尼酸（5-caffeoylquinic acid, 5-CQA）是咖啡酸与L-奎尼酸5位羟基形成的酯，其命名遵循Abrankó和Clifford基于L-奎尼酸编号的体系。5-CQA广泛存在于植物界，尤其在伞形目、菊目和川续断目中含量丰富。乌毛蕨科植物中亦存在blechnic acid等由两分子咖啡酸通过氧化偶联形成的木脂素类化合物，包括7-epi-blechnic acid、8-epi-blechnic acid和brainic acid等衍生物。

材料与方法

研究材料采集自德国多个植物园，共涵盖乌毛蕨科11属32种植物，覆盖所有3亚科。新鲜羽片经液氮冷冻干燥后，采用70%乙醇提取，通过Precellys组织研磨仪和超声辅助提取相结合的方式获得酚类化合物提取物。

定性分析采用LC/ESI-MS/MS系统（Agilent 1260系列液相色谱与Bruker micrOTOF-Q III质谱联用），以反相色谱柱（Multospher 120 RP 18）进行分离，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脱。定量分析使用Chromaster HPLC系统，以Hypersil ODS C18色谱柱进行等度洗脱（35%甲醇，0.01% H₃PO₄），以外标法对RA、5-CQA及blechnic acid B（BAB）进行定量。

从13.0 g冻干Neoblechnum brasiliense羽片中提取得到2.33 g粗提物，经制备型液相色谱（puriFlash系统）分离纯化，获得15.5 mg BAB纯品。通过LC/ESI-MS/MS测定其分子量为[M-H]^? 685.1523（分子式C₃₆H₃₀O₁₄），并利用SIRIUS和CSI:FingerID软件进行碎片谱解析。进一步通过一维/二维NMR（¹H, ¹³C, COSY, HSQC, HMBC）在CD₃OD中完成结构解析。为确定绝对构型，对BAB进行碱水解后，采用手性色谱柱（Chiralcel OD）分析其4-羟基苯乳酸单体构型。

结果

乌毛蕨科植物中酚类化合物的提取与鉴定

所有检测的乌毛蕨科植物均含有5-CQA（1），含量范围从Doodia heterophylla的0.01%干重至Blechnum gracile的1.78%。RA（2）仅发现于超级枝B的4个物种：Doodia maxima（0.07%）、Lomariocycas tabularis（0.07%）、Neoblechnum brasiliense（0.27%）和Oceaniopteris ciliata（0.11%）。此外，从N. brasiliense中分离得到一种新型化合物blechnic acid B（BAB, 7），含量达0.68%干重。

Blechnic acid B的结构解析

BAB的LC/ESI-MS/MS显示[M-H]^?峰为m/z 685.1523，MS2碎片包括m/z 503（丢失一分子4-羟基苯乳酸）、m/z 321（进一步丢失第二分子4-羟基苯乳酸）。NMR数据表明其结构为两分子咖啡酰-4′-羟基苯乳酸（isorinic acid）通过酯键连接形成的木脂素。H7″-H8″耦合常数（5.0 Hz）表明其为反式构型，而H7-H8耦合常数（16.0 Hz）确认双键为E式构型。手性色谱分析证实水解产生的4-羟基苯乳酸均为（R）-构型。

除BAB外，LC/ESI-MS/MS还检测到其羟基化衍生物：3′-羟基BLE（3）和3″-羟基BLE（6）（m/z 701.1449，碎片m/z 519和321）以及3′,3″-二羟基BLE（4）（m/z 717.1675，碎片m/z 519缺失）。这些化合物仅存在于N. brasiliense中。

酚类化合物的定量分布

在Blechnoideae亚科超级枝A中，Austroblechnum penna-marina subsp. alpina和A. penna-marina的5-CQA含量分别为0.16%和0.40%，Blechnum属8个物种含量介于0.09%-1.78%，均未检出RA。超级枝B中，Parablechnum属5个物种5-CQA含量为0.02%-1.28%，Doodia属为0.01%-0.32%（仅D. maxima含RA），Oceaniopteris gibba（0.21%-0.45%）、O. ciliata（0.17% + RA）、N. brasiliense（0.60% + RA + BAB）和L. tabularis（0.11% + RA）均显示特征性酚类谱。其他亚科如Stenochlaenoideae的Stenochlaena tenuifolia（0.83% 5-CQA）和Woodwardioideae的Woodwardia属（0.41%-0.79% 5-CQA）均未检出RA或BAB。

讨论

咖啡酰-5-O-奎尼酸在乌毛蕨科中的广泛分布

5-CQA在陆地植物中广泛存在，本研究证实其存在于所有检测的乌毛蕨科物种中，含量差异可能源于物种变异、环境因素或检测方法灵敏度。与早期研究（如Bohm, 1968）的部分阴性结果相比，现代LC/ESI-MS/MS技术提供了更高检测精度，表明5-CQA生物合成途径可能存在于乌毛蕨科祖先物种中。

迷迭香酸与blechnic acid B的特异分布

RA仅分布于超级枝B的4个属中，且同一属内存在有无RA的物种差异（如Doodia属仅D. maxima含RA），提示RA合成能力可能为次生获得或受环境调控。BAB及其衍生物仅发现于N. brasiliense，其结构类似于唇形科丹参中的丹酚酸B（salvianolic acid B），后者具有免疫调节和抗肿瘤活性（如抑制USP2-PD-L1通路增强T细胞杀伤活性）。BAB可能通过dirigent蛋白介导的异绿原酸与RA氧化偶联途径生物合成，而非先形成blechnic酸后酰化，因后者需要特异性CoA连接酶和BAHD酰基转移酶，目前尚无酶学证据支持。

系统发育与化学分类学意义

酚类化合物分布与乌毛蕨科系统发育高度吻合：5-CQA为保守性状，存在于所有分支；RA与BAB为衍生性状，特异性分布于超级枝B。该模式为蕨类植物次生代谢进化提供了化学分类学证据，同时提示乌毛蕨科植物可作为新型生物活性物质（如抗氧化、抗炎、抗肿瘤化合物）的潜在来源。