基于数字PCR和锈孢子萌发区分欧洲赤松疱锈菌单主与转主寄生型的生活史形式

本刊推荐：本研究开发了一种基于数字PCR（dPCR）的创新方法，通过靶向 mating-type 基因（bW1-HD1 和 bE1-HD2）和看家基因（TEF1-α）的拷贝数比值，高效区分 Cronartium pini 的单主（autoecious）与转主（heteroecious）寄生形式。该方法克服了传统接种试验耗时（2-6年）和SSR分型分辨率有限的瓶颈，并结合锈孢子萌发细胞学观察，揭示了两种形式在核行为与形态发生上的根本差异，为森林病原菌的快速鉴定与生物学研究提供了有力工具。

　　

1 引言

欧洲赤松疱锈病是瑞典松林中最具破坏性的病害之一，其病原菌为 Cronartium pini。该菌存在两种生活史形式：单主寄生型（autoecious form）仅侵染松属植物，而转主寄生型（heteroecious form）为长循环型，以松树作为锈孢子宿主，并以多种草本植物作为冬孢子宿主。两种形式在松树上引起的症状相似，且产生的锈孢子在形态上无法区分。传统的鉴别方法依赖于接种试验，该方法耗时长、通量低；而微卫星（SSR）分型提供的分辨率有限。近年来，基于 mating-type 基因的比较基因组研究表明，单主寄生型 Cronartium pini 在交配型位点上是纯合的，而转主寄生型则为杂合。这一发现为开发新的分子鉴别方法提供了理论基础。

2 材料与方法

2.1 用于多方法鉴定的样本收集

为实现在SSR分型、dPCR、孢子萌发和牡丹接种等多种方法间进行一致检测，每个样本需要大量锈孢子。因此，每个样本由从单棵欧洲赤松单个溃疡斑上收集的锈孢子混合而成。共采集20个锈孢子样本，分别来自瑞典耶姆特兰和北博滕省的不同地点。样本经干燥后真空密封保存，并于?20°C条件下储存，直至用于萌发试验和DNA提取。

2.2 DNA提取与SSR基因分型

使用Nucleospin Soil试剂盒提取DNA，并通过12个SSR标记进行基因分型。根据等位基因谱判断：若所有SSR标记均仅有一个等位基因，则样本为纯合型（单主寄生）；若任一标记存在两个等位基因，则为单杂合型；若存在两个以上等位基因，则为多杂合型（转主寄生混合基因型）。

2.3 TEF1、HD1-p 与 HD2-p 标记的开发与定量PCR

针对看家基因 TEF1-α 以及单主寄生型特异的 mating-type 基因等位点 bW1-HD1 和 bE1-HD2，设计特异性引物。通过定量PCR（qPCR）评估引物的扩增效率与灵敏度，标准曲线显示所有引物对均有高扩增效率（E=99.2%–103.8%）和相关系数（R2=1.000）。

2.4 数字PCR实验方案

采用QIAcuity数字PCR系统，在纳米孔板上同时检测TEF1、HD1-p和HD2-p三个标记。通过计算HD1-p:TEF1与HD2-p:TEF1的拷贝数比值，推断样本在交配型位点的接合性：比值接近1为纯合（单主寄生），接近0或0.5则为杂合（转主寄生）。

2.5 瑞典C. pini种群中HD1-p、HD2-p与TEF1的比值

对来自不同地区的168个单锈孢子器样本进行dPCR分析，结合历史存档样本，系统评估该方法的准确性与适用性。

2.6 离体牡丹叶片接种试验

使用花园牡丹（Paeonia × festiva）离体叶片进行接种培养，以验证生活史形式。转主寄生型样本在15天后可产生复孢子堆，而单主寄生型样本则无任何症状发生。

2.7 孢子萌发与显微镜观察

将锈孢子接种于水琼脂（WA）平板和多糖胺粘附载玻片上，在不同时间点观察萌发管形态、隔膜形成、核行为等细胞学特征，并采用乳酚棉蓝和DAPI染色进行形态与核行为分析。

3 结果

3.1 HD1-p、HD2-p与TEF1引物在qPCR与dPCR中的性能

生物信息学分析显示所设计引物具有高度特异性。qPCR标准曲线表明所有引物效率高、线性关系好。dPCR的一维信号图显示阳性与阴性分区明确，适合进行绝对定量。

3.2 接种试验验证的C. pini混合样本的SSR分型与dPCR结果

接种试验与SSR分型结果一致：所有单主寄生样本均为纯合型，转主寄生样本则显示杂合性。dPCR分析中，单主寄生样本的HD1-p:TEF1与HD2-p:TEF1比值接近1，而转主寄生样本该比值接近0、0.5或在0–0.5之间，反映其交配型基因的杂合状态。

3.3 单主与转主寄生型C. pini单锈孢子器样本中HD1-p:TEF1与HD2-p:TEF1的比值

dPCR分析表明，单主寄生样本的比值中位数接近1，且数据点紧密聚集于（1,1）附近；转主寄生样本的比值多接近0或0.5，且分散于坐标轴附近。该结果进一步验证了dPCR方法在区分两种形式上的准确性与可靠性。

3.4 单主与转主寄生型C. pini锈孢子萌发管的形态与核行为

3.4.1 转主寄生型C. pini样本

萌发管无隔膜，常呈二叉或三叉分支，顶端可形成附着胞样结构或复杂分支集群。DAPI染色显示，萌发管中有两个细胞核可紧密相邻也可远离，未见单核化现象。

3.4.2 单主寄生型C. pini样本

萌发管在泡囊（vesicle）形成前无隔膜，常形成一到多个泡囊，其后萌发管变细、出现隔膜，并产生1–4个单核芽体。核行为显示，两核在泡囊形成前共同迁移，之后每个细胞仅含一个细胞核。

4 讨论

本研究首次应用dPCR技术，通过 mating-type 基因拷贝数分析实现了对 Cronartium pini 单主与转主寄生形式的快速、准确鉴别。该方法显著提升了检测通量与效率，克服了传统接种试验和SSR分型的局限性。显微镜观察结果进一步从细胞学层面揭示了两者在萌发生物学上的本质差异：转主寄生型保持双核状态，而单主寄生型则通过泡囊形成实现单核化，这可能与其自交或同宗配合的生殖方式有关。

孢子萌发形态的比较澄清了历史上不同研究之间的描述差异，并支持单主寄生型锈孢子实质是一种“锈型冬孢子”（aecioid teliospore）的观点。此外，疏水性表面对泡囊形成的促进作用提示宿主表面特性可能在感染过程中起重要调控作用。

该研究不仅为森林病害监测提供了一种新的分子工具，也为理解锈菌生活史进化与宿主适应性提供了重要生物学见解。未来研究可进一步聚焦于不同形式 Cronartium 物种的功能基因组与转录组分析，以揭示锈菌宿主转主与有性生殖的分子机制。