用于骨组织工程的柠檬酸增强型聚氯乙烯（PCL）支架

《Advanced Materials Interfaces》：Citrate-Enhanced PCL Scaffolds for Bone Tissue Engineering

本研究开发基于聚己内酯（PCL）和FDA批准的柠檬酸盐基增塑剂的新型复合生物墨水，通过3D打印技术制造了四种骨组织工程支架模型（三重六边形、网格、gyroid、之字形）。实验表明，PCL/TBC复合墨水在促进细胞增殖和成骨分化方面效果最佳，三重六边形结构显示出最高的骨再生潜力。结果揭示了柠檬酸盐增塑剂在骨组织工程中的生物活性和机械性能增强作用。

　　在骨组织工程领域，构建具有功能性和结构支持性的三维支架是修复骨缺损的重要手段。本研究开发了一种基于聚己内酯（PCL）并结合美国食品药品监督管理局（FDA）批准的柠檬酸类塑化剂的新型复合墨水，以提高PCL在骨再生中的应用效果。该方法显著增强了PCL的机械强度、柔韧性和生物活性。通过使用这种复合墨水，研究者制造了四种不同的支架模型，包括三六边形、网格、gyroid和锯齿形结构。这些支架模型通过精确的挤出式增材制造技术进行制备，并通过化学表征、机械压缩测试、细胞增殖、成骨细胞分化以及基因表达评估来分析其在骨组织工程中的适用性。研究结果显示，与纯PCL支架相比，PCL/TBC和PCL/ATBC复合支架在细胞增殖方面提升了高达35%。在PCL/TBC组中，基因表达分析表明，成骨标志物如碱性磷酸酶（ALP）和骨形态发生蛋白（BMP）有显著上调。值得注意的是，核因子-κB受体激活剂配体（RANKL），该物质抑制细胞凋亡并促进破骨细胞的形成，未在任何组中表达。根据这些数据，所制备的支架表现出增强的成骨诱导能力。这些发现表明，PCL/TBC复合墨水和三六边形支架模型在通过3D打印促进骨修复方面具有巨大潜力。

### 骨缺损的挑战与传统治疗方法的局限性

骨缺损是多种因素导致的常见问题，包括事故、衰老、创伤和运动损伤。这些问题不仅影响患者的健康状况，还给医疗系统带来沉重的经济负担。目前，传统的骨移植方法如自体移植、异种移植和同种异体移植虽然在临床应用中占有重要地位，但也存在诸多局限。例如，自体移植虽然被认为是骨修复的“黄金标准”，因为其具备良好的成骨传导性和诱导性，但其可能导致供体部位的并发症，并增加手术的复杂性。而异种和同种异体移植虽然在材料来源上更广泛，但其风险包括疾病传播和宿主整合度有限。因此，寻找一种能够有效促进骨再生的新型生物材料成为当前研究的热点。

### 3D打印技术在骨组织工程中的应用

随着3D打印技术的迅速发展，其在生物医学领域的应用日益广泛。这种技术可以制造出高度定制化的支架，从而提高手术效果、改善患者个体化适配性，并推动组织工程研究的进步。通过使用先进的成像技术，如锥形束计算机断层扫描（CBCT），外科医生可以设计出更加符合患者需求的支架结构，从而优化其机械稳定性和生物整合性。此外，3D打印技术还可以用于制作手术导板和模型，帮助医生在术前进行详细规划，从而提高手术的精确性和成功率。

### PCL与柠檬酸类塑化剂的结合优势

PCL是一种FDA批准的合成高分子材料，以其良好的生物相容性、可降解性和机械强度在骨组织工程中具有广泛的应用前景。然而，PCL在实际应用中仍存在一些局限性，例如生物活性差、细胞附着性低以及降解速度慢，这些限制了其在促进组织再生方面的潜力。为了克服这些挑战，本研究引入了FDA批准的柠檬酸类塑化剂，包括三乙基柠檬酸（TEC）、三丁基柠檬酸（TBC）、三乙基2-乙酰柠檬酸（ATEC）和三丁基2-乙酰柠檬酸（ATBC）。这些塑化剂在骨组织中天然存在，并且已经被列入药典标准。它们的加入可以改善PCL与细胞的相互作用，提高其生物活性，从而增强支架的再生能力。

### 柠檬酸类材料的生物活性优势

与传统的可降解聚合物相比，柠檬酸类材料具有独特的生物活性优势。它们不仅能够提供机械支持，还能通过调节弹性、强度和降解速率来主动促进组织再生。这些材料的生物活性特性可以促进细胞附着和分化，并且其成本效益和可扩展性进一步增强了其在临床中的应用前景。近年来，柠檬酸类材料在骨科领域的表现令人印象深刻，例如，聚（1,8-辛二醇-共-柠檬酸）（POC）在韧带移植物固定中表现出更好的生物整合性，而Citregen的商业化则进一步证明了柠檬酸类材料在临床转化方面的潜力。

### 柠檬酸在骨组织形成中的生物学作用

柠檬酸在骨组织形成过程中扮演着至关重要的角色。它参与了羟基磷灰石纳米晶体的形成，这些晶体为骨骼提供了稳定性、机械强度和抗骨折能力。此外，一些研究表明，柠檬酸可以调节细胞的代谢过程，例如，Wu等人发现，补充柠檬酸可以增强骨髓间充质干细胞中PPARγ依赖的抗氧化蛋白的表达，显著降低细胞内活性氧（ROS）水平，从而减少炎症并保护成骨细胞免受氧化损伤。在体内研究中，Wu等人进一步证明，柠檬酸功能化的钙-磷酸盐支架可以重编程巨噬细胞代谢，使其向M2型、具有修复功能的表型转变，同时维持骨稳态并加速骨再生。这些发现表明，柠檬酸类分子在骨再生过程中可能具有重要的代谢调控作用。

### 3D支架结构对细胞行为的影响

在本研究中，四种不同的3D支架模型被设计和制备，以评估其结构特性以及对细胞增殖和分化的促进作用。这些模型包括三六边形、网格、gyroid和锯齿形结构。其中，三六边形模型具有最高的孔隙率（58.36%），其次是gyroid（56.48%）、锯齿形（55.06%）和网格（52.72%）。孔隙率的高低直接影响细胞的附着和营养物质的运输，因此支架的内部结构对细胞行为具有显著影响。为了进一步研究这些结构的特性，研究者采用了扫描电子显微镜（SEM）进行表面形态和孔隙结构的观察。结果表明，30°角度的旋转有助于形成连通的孔隙结构，从而促进细胞在支架内部的均匀分布和迁移。

### 3D打印支架的机械性能评估

为了评估这些支架的机械性能，研究者进行了压缩测试。测试结果显示，PCL/TBC和PCL/ATBC复合支架在延展性方面优于纯PCL支架。具体而言，PCL/TBC组表现出最高的延展性，而PCL/ATEC组则表现最差。这一现象可能与塑化剂对PCL分子链的移动性增强有关，从而改善其柔韧性和延展性。此外，研究者还分析了不同塑化剂对支架机械性能的影响，发现TBC和TEC的加入显著提高了PCL的延展性，同时降低了弹性模量。这些结果表明，塑化剂的类型对支架的机械性能具有重要影响，而TBC和TEC可能在促进骨再生方面具有更大的潜力。

### 体外评估：细胞增殖与成骨细胞分化

为了进一步评估这些支架对细胞增殖和成骨细胞分化的影响，研究者采用了体外实验方法。通过将细胞接种在支架上，并在不同时间点进行细胞活力检测，研究者发现，三六边形模型在所有实验组中表现出最高的细胞增殖率。此外，与纯PCL支架相比，TBC和ATBC复合支架在细胞增殖方面也显示出显著的提升。在成骨细胞分化方面，研究者通过Alizarin Red染色观察到，含有β-甘油磷酸盐（β-GP）和抗坏血酸（ASC）的培养基可以有效诱导成骨细胞的分化。实验结果表明，β-GP和ASC的补充显著促进了骨细胞的矿化过程，进一步验证了它们在促进成骨细胞分化中的作用。

### 基因表达分析：成骨相关基因的调控

为了深入理解这些支架对成骨过程的调控机制，研究者进行了基因表达分析。实验结果显示，在第7天和第21天，PCL/TBC组的成骨相关基因如碱性磷酸酶（ALP）、BMP2、BMP6、COL1A1、COL12A1、OPG、OSX、RUNX2、SMURF1、SMURF2、SOX9和SPARC的表达水平显著提高。相比之下，PCL/ATBC组虽然也表现出一定的基因表达上调，但其程度不如TBC组。值得注意的是，RANKL基因在所有实验组中均未表达，这可能意味着这些支架在促进破骨细胞形成方面具有抑制作用，从而有利于骨再生。

### 柠檬酸类材料对骨重塑的影响

骨是一种高度动态的组织，其形成和修复依赖于成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡。RANKL是一种关键的细胞因子，能够激活破骨细胞的受体RANK，从而促进破骨细胞的分化和成熟。然而，本研究发现，RANKL基因在所有组中均未表达，这可能表明这些支架在抑制破骨细胞活性方面具有积极作用。OPG则是一种能够结合RANKL并阻止其与RANK结合的蛋白质，从而抑制破骨细胞的形成。OPG的上调可能有助于减少骨吸收，促进骨再生。此外，SMURF1和SMURF2的表达在TBC组中显著增强，这可能意味着TBC通过促进RUNX2的泛素化降解，从而抑制成骨细胞的过度表达，防止骨过度增生。

### 柠檬酸类材料在骨再生中的潜力

研究还发现，柠檬酸类材料不仅能够促进成骨细胞的分化，还能够调节骨代谢过程。例如，柠檬酸可以通过调节脂肪酸β-氧化、脂肪酸合成、糖酵解和糖异生等代谢途径，影响细胞的代谢活性。此外，柠檬酸在骨形成过程中还能够促进羟基磷灰石纳米晶体的形成，从而增强骨的稳定性和强度。这些发现表明，柠檬酸类材料在骨组织工程中具有重要的应用潜力，尤其是在促进骨再生和骨整合方面。

### 研究的局限性与未来展望

尽管本研究取得了积极成果，但仍存在一些局限性。例如，实验主要在体外条件下进行，未能完全模拟体内复杂的生理环境。此外，研究仅使用了一种成骨细胞系，而实际应用中可能需要考虑多种细胞类型的相互作用。因此，未来的研究需要进一步探索这些材料在体内的生物相容性和长期疗效，并结合临床试验评估其在实际骨修复中的应用价值。此外，柠檬酸类材料在骨组织再生中的分子机制仍有待深入研究，这将有助于进一步优化其性能，并拓展其在再生医学中的应用范围。

### 结论

综上所述，本研究通过引入柠檬酸类塑化剂，成功提高了PCL在骨再生中的应用潜力，并结合3D打印技术，设计出具有优异机械性能和生物活性的支架模型。特别是三六边形模型在促进细胞增殖和成骨细胞分化方面表现出显著优势，显示出良好的骨再生能力。这些结果不仅为骨组织工程提供了新的思路，也为未来的临床应用奠定了基础。随着3D打印技术的不断发展，结合柠檬酸类材料的支架有望成为一种更加安全、有效和个性化的骨修复解决方案。