利用CRISPR技术构建缺乏肿瘤相关抗原的Raji细胞平台，以研究CAR-T细胞治疗过程中抗原的丢失情况

《Frontiers in Genome Editing》：CRISPR-mediated generation of a tumor-associated antigen-deficient Raji platform to investigate antigen loss in CAR-T cell therapy

本研究利用CRISPR/Cas9技术生成单、双、三敲除CD19、CD20、CD22的Raji细胞系，建立抗原逃逸模型。通过基因、转录和蛋白水平验证，证实敲除有效性。功能测试显示敲除细胞对对应CAR-T细胞产生耐药性，优于K562模型。该模型为CAR-T耐药机制研究和多靶点疗法开发提供工具。

　　CAR-T细胞疗法作为癌症免疫治疗的重要突破，尤其在血液系统恶性肿瘤治疗中展现出显著的疗效。然而，尽管该疗法在临床试验中取得了令人瞩目的成果，但其长期疗效仍面临诸多挑战，其中肿瘤相关抗原（TAA）的丢失是导致治疗耐药性的关键机制之一。这一现象在CD19靶向CAR-T细胞治疗中尤为突出，据统计，超过40%的患者在治疗后出现CD19抗原丢失，进而导致疾病复发。CD19是B细胞发育早期阶段的重要标志物，广泛参与B细胞受体信号传导，对于B细胞的存活和增殖至关重要。因此，抗原丢失不仅削弱了CAR-T细胞的识别能力，还成为临床治疗失败的重要原因。

为应对这一挑战，研究者们开始探索多靶点CAR-T细胞疗法，通过同时靶向多个B细胞标志物，如CD19、CD20和CD22，以降低抗原丢失带来的耐药风险。CD20和CD22同样在B细胞中发挥重要作用，CD20参与钙信号传导和细胞周期调控，而CD22作为抑制性共受体，调控B细胞受体信号通路。在临床试验中，靶向CD20和CD22的CAR-T细胞疗法已显示出较高的缓解率，但其治疗效果同样受到抗原丢失的限制。因此，开发能够准确模拟抗原丢失现象的细胞模型，对于深入理解CAR-T细胞疗法的耐药机制以及优化多靶点治疗策略具有重要意义。

目前，研究多依赖于来自复发患者的临床样本进行相关分析，但此类样本存在数量有限、获取周期长以及细胞维持难度大等问题，限制了研究的广泛性和可重复性。为解决这一困境，研究团队采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了一种新型的抗原丢失细胞模型。通过系统性地敲除CD19、CD20和CD22基因，研究者成功生成了单基因（sKO）、双基因（dKO）和三基因（tKO）敲除的Raji淋巴瘤细胞系。Raji细胞是一种源自人类伯基特淋巴瘤的细胞系，因其表面高表达CD19、CD20和CD22而被广泛用于研究CAR-T细胞疗法的抗原靶向性。

为了确保模型的稳定性和可比性，研究团队在敲除抗原之前，先构建了一种双报告系统，使Raji细胞同时表达荧光蛋白mCherry和生物发光标记物Luciferase。这一策略不仅提供了统一的生物发光背景，还便于后续进行荧光分选和高通量检测。通过这种方式，研究者能够在相同的遗传和细胞背景下，系统性地生成不同抗原组合缺失的细胞模型，从而更准确地模拟临床抗原丢失的情况。

在基因编辑过程中，研究团队首先在HEK293T细胞中筛选并验证了针对CD19、CD20和CD22的sgRNA。通过T7内切酶I检测，确认了这些sgRNA在靶向基因位点诱导的插入缺失（indels）效率。随后，将经过验证的sgRNA克隆至pX459载体，并在Raji细胞中进行转导。通过流式细胞术和荧光显微镜，确认了mCherry的稳定表达，同时通过qRT-PCR验证了Luciferase基因的转录水平。研究还进一步通过PCR和amplicon测序确认了基因编辑的完整性，确保了抗原丢失的模型构建具有较高的特异性。

在细胞功能验证方面，研究团队评估了敲除后的细胞增殖能力和存活率。结果表明，无论是单基因、双基因还是三基因敲除的Raji细胞系，其增殖和存活能力均与原始Raji细胞（Raji-WT）无显著差异。这表明，基因编辑并未对细胞的基本生理特性造成影响，从而保证了模型的可靠性。此外，通过免疫荧光和流式细胞术，研究团队进一步验证了CD19、CD20和CD22在敲除细胞中的表达缺失。这些细胞在抗原特异性CAR-T细胞共培养实验中表现出显著的抗性，与临床抗原丢失导致的复发情况高度一致。

为了进一步评估CAR-T细胞的抗肿瘤活性，研究团队使用了针对CD19、CD20和CD22的单靶点CAR-T细胞进行共培养实验。实验结果显示，CAR-T细胞在与表达相应抗原的Raji细胞共培养时，表现出剂量依赖性的细胞毒性，而在与抗原缺失的细胞共培养时，其杀伤能力显著降低。这一结果不仅验证了抗原丢失对CAR-T细胞疗法的影响，也证明了所构建的敲除细胞模型在模拟临床抗原丢失现象方面的有效性。此外，通过比较不同抗原组合缺失的细胞对CAR-T细胞的反应，研究团队还揭示了多靶点CAR-T细胞在应对抗原丢失时的潜在优势。

值得注意的是，研究团队还开发了一种基于生物发光的高通量检测方法，用于评估CAR-T细胞介导的细胞毒性。这种方法不仅能够定量分析细胞死亡情况，还支持在体外和体内环境中对肿瘤负担进行动态监测。这种技术的应用为CAR-T细胞疗法的深入研究提供了更加精准和高效的工具，有助于在更接近临床实际的环境中评估治疗效果。

在抗原丢失模型的应用方面，该研究不仅限于模拟单一抗原丢失，还涵盖了双抗原和三抗原丢失的情况。这使得模型能够更全面地反映临床中复杂的抗原丢失模式。例如，部分患者在CD19抗原丢失后，可能进一步出现CD20或CD22的丢失，导致治疗失败。通过构建双抗原丢失模型，研究团队能够更准确地模拟这些复杂情况，为CAR-T细胞疗法的优化提供了重要的实验基础。

此外，研究团队还对基因编辑过程中可能产生的脱靶效应进行了评估。通过NGS-based amplicon测序，确认了所使用的sgRNA在靶向基因位点的编辑效率，并排除了大部分潜在的脱靶突变。仅有一条针对CD19的sgRNA在非靶向区域显示出轻微的脱靶效应，但该区域缺乏已知的调控元件，因此对细胞功能影响可以忽略不计。这一结果进一步验证了模型的特异性，确保了抗原丢失的模拟具有较高的准确性。

研究结果表明，通过CRISPR/Cas9技术构建的Raji细胞抗原丢失模型，能够有效模拟临床抗原丢失现象，并为CAR-T细胞疗法的耐药机制研究和多靶点治疗策略的开发提供了可靠的实验平台。这些模型不仅可用于研究抗原丢失对CAR-T细胞功能的影响，还能够用于评估不同CAR-T细胞组合在应对抗原丢失情况下的疗效。这种系统性的研究方法有助于推动CAR-T细胞疗法的进一步发展，提高其在临床中的应用效果。

从研究的临床意义来看，这些抗原丢失模型为开发更有效的多靶点CAR-T细胞疗法提供了重要支持。多靶点CAR-T细胞疗法旨在通过同时靶向多个抗原，降低肿瘤细胞通过单一抗原丢失而逃避免疫识别的可能性。然而，由于缺乏系统性的抗原丢失模型，这类疗法的评估往往受到限制。通过构建Raji细胞的sKO、dKO和tKO模型，研究团队为多靶点CAR-T细胞疗法的优化提供了精准的实验工具，使得研究者能够在可控的环境中，系统性地比较不同治疗策略的效果。

此外，这些模型还能够用于研究抗原丢失的分子机制。通过分析敲除细胞的基因表达、蛋白表达以及信号通路变化，研究者可以更深入地理解抗原丢失如何影响CAR-T细胞的识别和杀伤能力。这种分子层面的研究不仅有助于揭示抗原丢失的生物学基础，还可能为开发新的抗肿瘤策略提供理论依据。

在实验设计上，研究团队采用了多种方法确保模型的准确性和可靠性。除了使用流式细胞术和免疫荧光技术评估抗原表达外，还通过qRT-PCR和生物发光检测评估细胞活性和杀伤效率。这些方法的结合不仅提高了实验的精确度，还确保了数据的可比性和可重复性。此外，研究团队还对实验条件进行了严格的控制，包括细胞培养、转导效率和共培养比例，以减少实验误差，提高结果的可信度。

总的来说，这项研究通过构建基于CRISPR/Cas9技术的Raji细胞抗原丢失模型，为CAR-T细胞疗法的耐药机制研究和多靶点治疗策略的开发提供了重要的实验基础。这些模型不仅能够准确模拟临床抗原丢失现象，还能够用于评估不同CAR-T细胞疗法在应对抗原丢失时的疗效。未来，这些模型有望进一步应用于体内实验，以更全面地评估抗原丢失对CAR-T细胞治疗的影响，并推动更有效的抗肿瘤免疫疗法的开发。