性类固醇激素通过雌激素特异性途径正反馈调控欧洲鳗垂体GnRH受体（gnrhr2）表达的体外与计算机模拟研究

本综述深入探讨了基础硬骨鱼类欧洲鳗（Anguilla anguilla）垂体GnRH受体（gnrhr2）表达受性腺激素调控的分子机制。研究通过体外实验证实雌二醇（E2）和睾酮（经芳香化酶转化）显著上调gnrhr2转录水平，而激活素（activin）则起抑制作用；结合计算机模拟分析启动子区域，揭示了保守的转录因子结合位点（如CRE、AP1、GRAS），为理解脊椎动物GnRH受体调控的进化保守性提供了关键见解。

　　

1 引言

脊椎动物中，促性腺激素释放激素（GnRH）是控制生殖轴（下丘脑-垂体-性腺轴）的关键脑部因子。这种神经激素通过特异性G蛋白偶联受体——GnRH受体（GnRHR）作用于垂体，诱导促性腺激素（黄体生成素LH和卵泡刺激素FSH）的合成与释放。在哺乳动物中，GnRHR1主要参与垂体促性腺激素的调控，而GnRHR2则在大脑和外围组织中发挥其他功能。在基础硬骨鱼类如欧洲鳗中，GnRHR的表达调控机制尚不明确，但其独特的生命周期和生殖停滞现象使其成为研究生殖内分泌调控的理想模型。

2 材料与方法

研究使用处于银鳗阶段（生殖迁移前的预备期）的雌性欧洲鳗。垂体细胞通过酶解和机械分散法进行原代培养，并在无血清培养基中维持。细胞培养24小时后，分别用不同浓度的类固醇激素（雌二醇E₂、睾酮T、孕酮P、皮质醇F）、芳香化酶抑制剂法倔唑（fadrozole）以及激活素A和B处理8天。通过实时定量PCR（qPCR）检测gnrhr2转录水平，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因。

此外，研究通过计算机模拟分析欧洲鳗和日本鳗gnrhr2基因的启动子区域（ATG上游约2 kb），使用PROMO和JASPAR数据库预测转录因子结合位点，并与其他硬骨鱼类（斑马鱼、青鳉）和哺乳动物（人、小鼠）的gnrhr启动子进行比对，以评估调控元件的进化保守性。

3 结果

3.1 类固醇激素对鳗鱼垂体细胞gnrhr2转录水平的影响

E₂和T在10^–9 M和10^–7 M浓度下显著增加gnrhr2 mRNA水平（分别提高10倍和13倍），而P和F无显著效应。非芳香化雄激素11-酮基睾酮（11-KT）不诱导gnrhr2表达，且T的刺激作用在芳香化酶抑制剂法倔唑存在下被完全抑制，表明调控具有雌激素特异性。

3.2 激活素对gnrhr2表达的抑制作用

激活素A（10^–10 M和10^–8 M）和激活素B（10^–8 M）显著降低gnrhr2转录水平（分别降至对照的0.4倍和0.36倍），提示激活素在垂体水平负反馈调控GnRH敏感性。

3.3 gnrhr2基因结构与启动子分析

欧洲鳗和日本鳗的gnrhr2基因均包含3个外显子和2个内含子，编码435个氨基酸的蛋白，序列一致性达96.79%。启动子分析发现多个保守的转录因子结合位点，包括cAMP响应元件（CRE）、类固醇生成因子1（SF1）、下游激活素调控元件（DARE）、LIM/homeobox蛋白LHX3结合位点（LHX3）、GnRH受体激活序列（GRAS）、激活蛋白1（AP1）以及GnRH响应序列（SURG1和SURG2）。这些元件在硬骨鱼类和哺乳动物中高度保守，表明gnrhr调控机制在脊椎动物中具有古老起源。

3.4 跨物种启动子比较

与哺乳动物gnrhr1启动子相比，硬骨鱼类gnrhr2启动子缺乏典型的雌激素响应元件（ERE），但包含CRE、AP1和GRAS等非经典调控元件，提示雌激素可能通过间接途径（如CREB和AP1介导）调控基因表达。

4 讨论

4.1 gnrhr启动子调控元件的进化保守性

研究表明，欧洲鳗gnrhr2启动子中的响应元件（如CRE、SF1、DARE、LHX3、GRAS、AP1、SURG）与哺乳动物gnrhr1启动子高度相似，提示垂体特异性表达和激素响应机制在脊椎动物中广泛保守。这些元件可能通过招募保守的转录因子（如OCT1、NFY、SMAD、FOXL2）调控基因表达。

4.2 雌激素特异性调控的分子基础

E₂和T（经芳香化）对gnrhr2的正反馈作用与哺乳动物中雌激素增强垂体GnRH敏感性的机制一致。启动子中缺乏典型ERE但存在CRE和AP1位点，表明雌激素可能通过激活CREB或AP1间接调控转录，这与哺乳动物中的非经典途径类似。

4.3 激活素的抑制作用与机制

激活素对gnrhr2的抑制效应与其对lhβ的抑制一致，提示其在调节LH细胞功能中起关键作用。GRAS和DARE元件的存在表明激活素可能通过SMAD信号通路调控基因表达，但具体机制需进一步验证。

4.4 其他激素的调控作用

孕酮和皮质醇对gnrhr2表达无直接影响，与某些哺乳动物中的结果一致。启动子中缺乏孕酮响应元件（PRE）和糖皮质激素响应元件（GRE），进一步支持其调控可能依赖间接机制或物种特异性因素。

5 结论与展望

本研究首次揭示了欧洲鳗垂体gnrhr2表达受性类固醇（通过雌激素途径）正反馈和激活素负反馈的双重调控，并通过计算机模拟揭示了启动子中保守的转录因子结合位点。这些发现不仅深化了对硬骨鱼类生殖内分泌调控的理解，也为比较脊椎动物GnRH受体进化提供了重要依据。未来研究应聚焦于启动子元件的功能验证、细胞特异性表达（如LH与FSH细胞）以及环境因子（如信息素）对GnRH释放的上游调控，从而为人工诱导鳗鱼成熟和排卵提供新策略。