基于致死性内毒素(ccdB)的反向选择提升大肠杆菌中连续基因编辑效率

为解决CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌连续基因编辑中存在的质粒（尤其是sgRNA质粒）清除效率低下的问题，来自国内的研究团队开发了一种基于ccdB毒素的反向选择策略。该研究在W衍生菌株中实现了cstA与ppsA基因的高效连续敲除，sgRNA质粒转化效率达108–109 cfu/μgDNA，重组率超93%，并通过温度诱导的ccdB/sacB系统实现质粒高效清除。该方法显著提升了连续基因编辑的整体效率，为细菌基因组改造提供了新方案。

　　

基于CRISPR/Cas9的技术已被用于大肠杆菌（Escherichia coli）中的连续基因编辑。在每轮编辑后，携带sgRNA和/或Cas9基因的质粒需要被清除，而这些质粒（特别是sgRNA质粒）的清除过程限制了连续基因编辑的效率。本研究建立了一种基于致死性内毒素（ccdB）的反向选择方法，用以提高大肠杆菌中连续基因编辑的整体效率。该方法在HBUT-P2菌株（W衍生系）中针对cstA和ppsA基因的连续编辑（缺失）进行了验证。实验结果表明，sgRNA质粒（pTargetF-tcr-P_L-ccdB-N20）的转化效率达到10⁸–10⁹ cfu/μg_DNA，使cstA和ppsA基因的重组率分别达到100%和93.75%。在完成cstA基因编辑后，通过42°C下基于ccdB的反向选择，有效清除了sgRNA质粒（pTargetF-tcr-P_L-ccdB-N20 (cstA)），清除效率为43.75%。在ppsA基因连续编辑结束时，通过将细胞培养在含5%蔗糖的LB平板并于42°C孵育，同时利用sacB和ccdB反向选择，实现了Cas9（25A）和sgRNA（pTargetF-tcr-P_L-ccdB-N20 (ppsA)）质粒的同时清除，Cas9质粒（25A）清除率为100%，sgRNA质粒清除率为37.5%，两种质粒同时清除的比例为37.5%。此外，该方法还通过在DH5α（K12衍生系）和S322（C衍生系）菌株中将csc操纵子高效定点插入slmA基因中得到了进一步验证。这些结果表明，基于内毒素（ccdB）的反向选择提高了sgRNA质粒的转化效率、编辑靶基因的重组率、sgRNA质粒的清除率以及连续基因编辑的整体效率。