结构光照明与探测协同突破：ISM-FLUX实现单分子定位新范式

为解决MINFLUX技术定位范围窄、易丢失分子的问题，研究人员开发了ISM-FLUX技术，将结构光照明（环形光斑）与SPAD阵列的结构化探测相结合，将单分子定位范围扩展至600×600 nm2，显著提升活细胞追踪鲁棒性，并首次实现同一分子吸收与发射位点的独立探测。

　　

在生命科学研究的微观世界里，科学家们一直致力于追踪单个分子的运动轨迹，以期揭示生物大分子的动态行为机制。单分子追踪技术和基于单分子定位的超分辨显微技术（SMLM）如PALM、STORM和PAINT，通过宽场成像结合相机检测，实现了纳米尺度的定位精度。然而，这些方法在活细胞应用中面临巨大挑战：光子效率低、时间分辨率有限，且需要较高的荧光分子发射密度。

近年来，一种名为MINFLUX的革命性技术横空出世，它采用序列式结构光照明（通常使用环形光斑）结合点探测器，将定位精度提升至1-2纳米，仅需约1000个光子即可实现单分子定位。但MINFLUX存在明显局限：待定位分子必须位于照明光的目标坐标模式（TCP）内（≤200纳米），若分子偏离此区域，则无法唯一确定其位置，导致追踪中断。这一缺陷严重限制了其在活细胞复杂环境中的应用可靠性。

正是在此背景下，Slenders等人于《Light: Science & Applications》发表了突破性研究，提出ISM-FLUX技术——一种融合结构光照明与结构化探测的新型单分子定位方案。该技术基于标准共聚焦显微镜架构，在激发光路中引入涡旋相位板（VPP）产生环形聚焦光斑，并在检测端用单光子雪崩二极管（SPAD）阵列替代传统点探测器，结合时间相关单光子计数（TCSPC）单元实现光谱测量。

关键技术方法包括：1）通过振镜扫描环形光束实现序列式结构照明；2）采用SPAD阵列捕获分子荧光空间分布；3）利用TCSPC技术同步获取光子时间信息；4）基于开源硬件和软件平台（如PyFocus）进行系统校准与数据处理。

研究结果显著体现在三个方面：

（i）扩展定位范围与提升鲁棒性

通过利用阵列探测器提供的空间信息，ISM-FLUX将有效定位区域扩展至600×600 nm2，较MINFLUX提升近9倍。这使得单分子追踪过程中即使分子暂时偏离TCP中心仍能被准确定位，极大增强了活细胞长时程追踪的稳定性。

（ii）简化系统架构与促进技术普及

基于振镜扫描的开放式设计使TCP校准更简便，同时依托开源硬件（如主动样品稳定系统）和软件（如PyFocus光学场计算包），降低了技术复现门槛，有望推动MINFLUX类技术在更多实验室的应用。

（iii）独立探测吸收与发射位点

ISM-FLUX首次实现对同一分子光吸收和光发射位置的独立解析。通过分别分析结构照明序列与结构检测数据（而非简单叠加），可研究共轭聚合物、J型聚集体和光捕获复合物（LHC）等体系中吸收与发射空间解离现象。同时保留的单光子计数能力支持荧光寿命和光子（反）聚束等光谱测量。

该研究的核心结论在于：ISM-FLUX通过协同利用结构照明与结构化探测，不仅解决了MINFLUX的技术瓶颈，更开创了单分子定位显微的新范式。其扩展的定位范围使活细胞单分子追踪更加可靠，开源化设计促进技术推广，而独立探测吸收/发射特性的能力为研究纳米尺度光物相互作用提供了全新工具。这项技术有望推动超分辨显微从“看得更清”向“看得更动态、更深入”迈进，为生命科学和材料科学领域带来突破性进展。