氧化应激相关过氧化物氧还蛋白Tsa1b在耳念珠菌（Candidozyma auris）致病性与感染过程中的作用机制研究

本研究针对耳念珠菌（Candidozyma auris）因鉴定困难和耐药性高导致的临床防控难题，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Δtsa1b突变株，发现其氧化应激响应蛋白Tsa1b的缺失显著削弱真菌对环境胁迫及免疫细胞的抵抗能力，并延缓体内感染进程。该成果为开发新型抗真菌疗法提供了潜在靶点。

　　

近年来，侵袭性真菌感染（IFI）的发病率和死亡率持续攀升，其中耳念珠菌（Candidozyma auris，原名Candida auris）因其多重耐药性和高传播性，被世界卫生组织列为紧急威胁病原体。该菌对常用消毒剂和宿主免疫系统产生的活性氧（ROS）具有显著抵抗力，这使得临床感染控制和治疗面临巨大挑战。氧化应激响应作为真菌应对环境压力的核心机制，成为揭示其致病性的关键突破口。

为深入解析耳念珠菌的氧化应激调控网络，研究人员通过转录组与蛋白质组学联用技术，发现硫氧还蛋白依赖性过氧化物氧还蛋白（Thioredoxin-dependent peroxiredoxin Tsa1b）在过氧化氢（H₂O₂）胁迫下表达显著上调。为进一步验证其功能，团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了Δtsa1b缺失突变株及回补株，并通过体外应激实验、免疫细胞共培养、小鼠及大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型等多维度手段开展系统性研究。

本研究主要采用以下关键技术：1）CRISPR-Cas9基因编辑构建遗传突变株；2）二维电泳（2-DE）联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析；3）流式细胞术定量细胞壁β-葡聚糖和几丁质；4）树突状细胞（DCs）与骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）体外共培养模型；5）小鼠系统性感染模型及组织病理学分析。临床分离株来源于西班牙La Fe医院血流感染患者。

3.1 耳念珠菌分离株特性表征

通过比较5株临床分离株与白念珠菌、希木龙念珠菌在不同应激条件（CFW、CR、SDS、H₂O₂等）下的生长情况，发现耳念珠菌对氧化应激和细胞壁干扰剂具有更强耐受性。药敏试验显示所有分离株对氟康唑耐药，但对两性霉素B和米卡芬净敏感。

3.1.1 氧化应激相关基因表达分析

RT-qPCR结果显示，在8 mM H₂O₂处理下，CAT1、SOD1、SOD6、TSA1B和CCP1基因在8小时显著上调，其中CAT1、TSA1B、CCP1和SOD1在16小时仍维持高表达。24小时后部分基因出现下调，提示应激响应动态调节。

3.1.2 氧化应激下上调蛋白的鉴定

二维电泳鉴定出15个显著上调蛋白，包括与蛋白质合成（Uba1、Cef3、Rps等）、甲硫氨酸代谢（Met6、Fau1）及糖酵解途径（Mdh1、Aco1）相关的分子。生物信息学分析显示这些蛋白与人类同源性较低（30-86%），具有潜在治疗靶点价值。

3.2 Tsa1b蛋白的抗原性研究

Western blot验证患者血清可识别Tsa1b、Met6和Mdh1蛋白，表明Tsa1b在感染过程中可能触发宿主免疫应答。

3.2.1 Tsa1b对环境应激及细胞壁组成的影响

Δtsa1b突变株对H₂O₂和刚果红（CR）敏感性显著增加。流式细胞术检测发现突变株在氧化应激下β-葡聚糖暴露量增加，但抗真菌药物敏感性未改变。

3.2.2 Tsa1b在免疫细胞互作中的作用

与树突状细胞和巨噬细胞共培养后，Δtsa1b株存活率显著降低，且巨噬细胞对其吞噬能力下降。ROS检测显示突变株感染组活性氧水平升高，提示Tsa1b缺失削弱了真菌的氧化应激防御能力。

3.3 Tsa1b在体内感染中的功能

大蜡螟感染模型显示Δtsa1b株致病性延迟，感染7天后仍有6.25%存活率（野生株全部死亡）。小鼠系统性感染实验中，突变株在肾脏和大脑中的载菌量降低，脾脏重量减轻，临床症状进展缓慢。组织病理学显示肾脏出现肉芽肿性炎症，但三组间损伤程度无显著差异。

本研究首次系统揭示了耳念珠菌Tsa1b蛋白在氧化应激响应和致病过程中的双重功能。该蛋白不仅参与真菌对宿主ROS的解毒过程，还调控细胞壁β-葡聚糖代谢，影响免疫识别和吞噬效率。突变株在体内外实验中表现的 attenuated virulence（减毒表型）表明Tsa1b是潜在的治疗靶点。值得注意的是，Δtsa1b株通过上调其他抗氧化基因（CAT1、SOD1等）实现部分功能补偿，提示氧化应激网络的复杂性。

该研究为理解耳念珠菌耐药机制和宿主互作提供了新视角，Tsa1b的抗原性特征更为诊断试剂和疫苗开发提供了理论基础。未来需进一步探索Tsa1b与其他抗氧化元件的协同机制，以及其在不同耳念珠菌分支（Clade）中的保守性，为多重耐药真菌感染的防控策略提供新方向。