CRISPR/Cas9介导黑曲霉蛋白酶基因敲除与发酵优化协同提升脂肪酶活性研究

本研究针对脂肪酶在发酵过程中易被蛋白酶降解的关键问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除黑曲霉AnCALB005菌株的蛋白酶基因（pepA、pepB、pepF等），结合Plackett-Burman设计和Box-Behnken响应面法优化发酵参数，使摇瓶发酵脂肪酶活性提升92.01%，5L生物反应器规模达到79.31 U/mL，为工业酶制剂高效生产提供了创新策略。

　　

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对黑曲霉（Aspergillus niger）AnCALB005工业菌株进行多蛋白酶基因（包括pepA、pepB、pepC、pepE和pepF）敲除，成功获得三基因缺陷型工程菌（缺失pepA/pepB/pepF），其水解性脂肪酶（lipase）活性较原始菌株提升56%。研究团队采用单因素实验初步筛选发酵条件，通过Plackett-Burman设计锁定关键影响因素（麦芽糖浓度、玉米浆浓度和摇床转速），结合最陡爬坡实验与Box-Behnken响应面法进行系统优化。最终确定最佳发酵体系为：麦芽糖52 g/L、玉米浆52 g/L、K₂HPO₄ 5 g/L、豆饼粉30 g/L、初始pH 6.5、接种量10% (v/v)、转速220 rpm。优化后摇瓶发酵脂肪酶活性达46.66 U/mL（提升92.01%），在5 L生物反应器中经120小时培养更获得79.31 U/mL的高酶活成果，显著提升了南极假丝酵母（Candida antarctica）B型脂肪酶的生产效率。