利用CRISPR混合文库大规模筛选甘蓝型油菜角果长度与种子大小的关键基因

本研究针对甘蓝型油菜产量提升的瓶颈问题，通过整合转录组关联分析（TWAS）、组织特异性表达谱与已知基因数据，筛选出1905个角果发育与种子大小调控候选基因。研究团队构建了靶向1739个基因的6124条sgRNA文库，通过农杆菌介导的遗传转化获得681株T0代转基因植株，编辑效率达37%。成功获得10株纯合突变体，初步验证了BnaHRDs基因在株高（PH）、主花序长度（MIL）、角果长度（SL）及千粒重（TSW）等农艺性状中的调控作用，为油菜高产育种提供了新基因资源和研究方法框架。

　　

研究背景：破解油菜产量瓶颈的基因密码

甘蓝型油菜作为全球重要的植物油来源，其产量提升直接关系到食用油安全。然而，油菜产量深受角果发育和种子大小的制约，而相关遗传资源的匮乏限制了育种进展。角果不仅是种子的保护壳，更在种子发育后期参与贮藏物质的积累；种子大小则是决定产量的关键因素。尽管激素代谢和信号转导基因已被证实参与调控这些过程，但多倍体油菜基因组的复杂性使得功能基因研究举步维艰。传统QTL定位和正向遗传学策略效率低下，而基于其他作物的反向遗传学方法又存在物种特异性限制。因此，迫切需要一种高效策略来挖掘油菜角果和种子发育的调控基因。

技术方法亮点

研究团队整合多源数据筛选候选基因，利用CRISPR-P 2.0设计sgRNA文库，通过寡核苷酸阵列大规模合成并构建农杆菌库。采用农杆菌介导的下胚轴遗传转化系统获得T₀代植株，通过Hi-TOM高通量测序技术检测编辑效率，并利用加速育种平台筛选纯合突变体。 phenotypic analysis涵盖株高（PH）、主花序长度（MIL）、角果长度（SL）、单株有效角果数（ENS）、每角果粒数（SNPS）和千粒重（TSW）等性状。

研究结果

候选基因筛选与整合

通过转录组宽关联分析（TWAS）从505个自交系群体中筛选出与含油量、蛋白质含量、壳百分比和千粒重（TSW）显著相关的1472个基因，结合文献报道的395个基因和89个角果特异性表达基因，最终整合出1905个候选基因。值得注意的是，TWAS筛选的基因与已报道基因重叠度低，提示油菜角果发育机制可能不同于模式植物。

突变体库构建与质量评估

针对同源拷贝≤4的1739个基因设计6124条sgRNA，平均每个基因3.52条。质粒库覆盖率达99.90%，sgRNA分布偏差值4.94；农杆菌库覆盖率达99.93%，偏差值4.53，显示文库具有高度均匀性和覆盖度。

随机转化与编辑效率分析

681株T₀代再生植株中检测到453条sgRNA，71.51%为单sgRNA植株。408株检测个体中151株（37.00%）发生编辑，51.41%的sgRNA有效。编辑类型以单碱基插入为主（A>T>C>G），其次为多碱基缺失。

T₁代纯合突变体筛选

从19个T₀株系中成功获得10个纯合突变系，靶向AT2G36450（BnaHRDs）、AT5G57790等基因同源拷贝。编辑事件稳定遗传，并发现新型编辑模式（如T₁-B83-1中3bp缺失变为4bp缺失），提示Cas9蛋白的持续活性。

BnaHRDs基因的生物信息学与表型分析

BnaHRDs（同源于AT2G36450）编码AP2结构域转录因子，在根、茎和发育角果中特异性表达。蛋白序列高度保守（77.9-80.5%相似性），但不同拷贝表达模式存在差异。三种纯合突变体（T₁-A03-15、T₁-A03-21、T₁-A29-26）均出现PH、MIL、SL降低和ENS减少，SNPS增加但TSW下降，其中BnaHRD.A03突变对表型影响尤为显著。

结论与意义

该研究成功构建了油菜首例针对角果和种子大小性状的CRISPR/Cas9编辑库，实现了多倍体作物中的高通量基因筛选。尽管存在转化效率、受体品种局限性和部分同源基因编辑不全等问题，但研究证实了BnaHRDs等基因在油菜农艺性状调控中的重要作用，为高产育种提供了新靶点。该方法框架为多倍体作物的快速基因功能解析提供了可推广的策略，对提升油菜及其他复杂基因组作物的遗传改良效率具有深远意义。