综述：微生物中有价值的萜类风味化合物及其前体可持续生物合成的进展

本综述系统总结了利用大肠杆菌和酵母作为底盘生物合成高价值萜类风味化合物及其前体的最新进展，涵盖萜类（terpenoids）生物合成机制、代谢工程策略（如模块化途径设计、CRISPR/Cas9基因组编辑、酶工程、细胞器区室化等），并探讨了提高产量和工业应用潜力的关键技术挑战（如细胞毒性、前体供应限制和规模化发酵优化）。

　　

工程化大肠杆菌生产萜类风味化合物及前体

大肠杆菌凭借其生长周期短、遗传操作简便和高碳利用效率的优势，成为萜类生物合成的理想底盘生物。通过异源引入甲羟戊酸（MVA）或甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径，并优化关键酶（如萜合酶）的表达，研究人员已实现多种萜类化合物的高效生产。例如，香叶醇（geraniol）的产量通过融合标签进化和代谢通量调控达到2124.1 mg/L；柠檬烯（limonene）在3.1 L发酵罐中产量达3.6 g/L；而通过蛋白质支架策略和RBS修饰，芳樟醇（linalool）产量提升至4160 mg/L。此外，前体化合物如顺式冷杉醇（cis-abienol）通过异戊烯醇利用途径（IUP）优化，产量达1375.7 mg/L。

酵母作为萜类生物合成的真核工厂

酵母（如酿酒酵母和耶氏酵母）因其内质网等细胞器支持复杂酶功能（如细胞色素P450依赖的反应）而优于原核系统。通过启动子工程（如用HXT1替换ERG9启动子）、代谢网络重编程（如下调麦角固醇合成路径）和细胞器区室化（如线粒体和过氧化物酶体靶向），萜类产量显著提高。例如，α-檀香烯（α-santalene）产量达2.9 g/L；诺卡酮（nootkatone）通过P450酶工程产量达2.39 g/L；而紫穗槐二烯（sclareol）通过双酶支架策略在发酵罐中产量达12.9 g/L。酵母还适用于生产四萜类如β-胡萝卜素（β-carotene），产量通过消除番茄红素（lycopene）抑制提升至39.5 g/L。

提升萜类生物合成效率的策略

1. 1.
   模块化途径工程：将合成路径分解为上游前体供应、核心骨架合成和下游修饰模块，实现通量平衡。例如，Zhang等通过四模块系统在E. coli中生产番茄红素（107 mg/L），并衍生出α-紫罗兰酮（480 mg/L）和β-紫罗兰酮（500 mg/L）。
2. 2.
   基因组编辑技术：CRISPR/Cas9及其变体（如CRISPRa/i）用于精确调控基因表达。Lian等通过上调HMG1和下调ERG9，使β-胡萝卜素产量提高3倍。
3. 3.
   酶工程与级联催化：通过定向进化、理性设计和蛋白质融合提升酶活性和稳定性。Kang等利用Mi3蛋白笼固定酶，使番茄红素产量提高8.5倍。
4. 4.
   细胞器区室化与转运工程：将合成途径靶向线粒体或过氧化物酶体以利用局部高前体浓度。Matsumoto等将胡萝卜素合成途径定位至线粒体，产量提高13.8倍。
5. 5.
   适应性实验室进化（ALE）：增强宿主对萜类细胞毒性的耐受性。Niu等通过ALE获得耐受2% α-蒎烯的E. coli菌株，产量提高31%。
6. 6.
   生物衍生化：通过乙酰化或糖基化将毒性化合物（如香叶醇）转化为低毒衍生物（如乙酸香叶酯），产量达19.0 g/L。
7. 7.
   共培养系统：分工合成路径以减轻代谢负担。Qi等用E. coli和酵母共培养生产二氢-β-紫罗兰酮，产量提高3.4倍。
8. 8.
   发酵优化策略：包括两阶段发酵、微氧发酵和两相萃取。Zhang等通过动态调控葡萄糖响应启动子，使β-石竹烯（β-caryophyllene）产量达21.4 g/L；Tan等采用十二烷两相系统，将反式橙花叔醇（trans-nerolidol）产量从7 g/L提升至16 g/L。

展望与挑战

尽管微生物合成萜类化合物取得显著进展，但生产成本仍高于化学合成法。关键挑战包括萜合酶的低催化活性、产物细胞毒性以及非传统宿主基因编辑工具的低效性。未来需结合宿主耐受性工程、酶进化技术和规模化发酵优化，以实现萜类风味化合物的经济可行和可持续工业生产。