非对称体积介导的缓冲控制机制克服了一锅法RAA-CRISPR/Cas12a视觉检测中的灵敏度限制

快速低成本且可视化的核苷酸检测方法对于遏制通过食物链传播的抗生素耐药基因至关重要。本研究通过体积不对称优化，将CRISPR/Cas12a与重组酶辅助扩增（RAA）结合，提出了一种新型一锅法检测体系。该设计将最小体积的RAA-MIX（盖部）与CRISPR优势缓冲液微环境（管底）空间分隔，在混合后自动实现缓冲液协同，使检测灵敏度达到2.5 copies/反应，成本降低63.1%，并有效抑制其他质粒和细菌的干扰。实验验证了该方法在动物源性食品中检测mcr-1基因的实用性。

　　

摘要

快速、低成本且具有可视化功能的核酸检测方法对于遏制通过食物链传播的粘菌素耐药性具有极大的吸引力。CRISPR/Cas12a与重组酶辅助扩增（RAA）相结合，提供了一种无需使用气溶胶的、一步完成检测的方法。然而，传统的单步系统通常在适用于RAA的缓冲液中执行Cas12a的切割反应，这限制了Cas12a的切割效率。本研究提出了一种基于体积优化的RAA-CRISPR/Cas12a检测方法，能够超灵敏地可视化检测可移动的粘菌素耐药基因mcr-1。与传统受缓冲液兼容性限制的单步系统不同，我们的设计将体积最小的RAA混合液（位于盖子部分）与CRISPR主导的缓冲液微环境（位于试管底部）空间分离。这种架构利用了RAA的指数级扩增能力，确保在最小反应体积下仍能获得足够的产物产量，并通过混合时自动吸收缓冲液来增强后续的Cas12a切割反应。实验结果可在紫外光下直接观察，与标准单步方法相比，成本降低了63.1%。该方法对mcr-1基因的检测灵敏度为每反应2.5个拷贝，并且能够有效排除其他质粒或细菌的干扰。该方法已应用于动物源性食品中mcr-1的检测，显示出令人满意的实际应用效果。通过从根本上改变缓冲液微环境的体积不对称性，本研究为单步分子诊断提供了一种通用策略，实现了扩增和切割效果的双重优化，且无需任何权衡。

图形摘要