RHOA作为宿主依赖性因子在副猪格拉瑟菌感染LLC-PK1细胞中的新功能及其调控机制研究

本研究聚焦副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）感染机制，通过构建猪肾上皮细胞（LLC-PK1）感染模型，首次揭示RHOA基因在细菌感染中的关键作用。研究人员发现RHOA敲除可显著降低细菌黏附与侵袭能力，并将细胞存活率从0.75%提升至77.30%。转录组分析表明RHOA通过调控细胞骨架重组（ACTG1/MYL7/MYL9下调）和紧密连接稳定性（CDH1/CLDN1/CDH5上调）间接影响感染进程。该研究为Glasser病防控提供了新的宿主靶点，对猪细菌性疾病防治具有重要科学价值。

　　

在养猪业中，有一种被称为Glasser病的致命性疾病正持续威胁着全球猪群的健康。这种疾病的元凶——副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis, G. parasuis），是一种革兰氏阴性短杆状细菌，它通常悄无声息地定居在健康猪的上呼吸道黏膜表面。当猪只遭遇应激状况时，这种机会性病原体便会突破黏膜屏障进入血液，引发全身性炎症反应，导致多发性浆膜炎、肺炎、关节炎和脑膜炎等严重症状。在中国，血清5型、13型、4型和12型菌株的毒力最强，不仅直接造成死亡，还常与其他细菌或病毒协同感染，使防治工作难上加难。

尽管研究人员已知G. parasuis能够通过分泌IgA蛋白酶降解宿主体内的免疫球蛋白A，逃过黏膜免疫防御，并破坏上皮细胞间的连接结构，但宿主细胞内部究竟如何响应这种细菌入侵，其分子机制至今仍笼罩在迷雾之中。特别值得注意的是，Rho GTP酶家族中的重要成员——Ras同源基因家族成员A（RHOA），虽然在病毒侵染过程中已被广泛研究，但在细菌感染领域却鲜有人涉足。以往研究发现，在猪沙波病毒（PSaV）和经典猪瘟病毒（CSFV）感染中，RHOA被激活后能调控肌动蛋白细胞骨架的动态变化，帮助病毒进入细胞；相反，在伪狂犬病毒（PRV）感染中，高表达RHOA反而抑制病毒复制。这种因病原体不同而表现出的功能双重性，使得RHOA在宿主-病原体相互作用中显得尤为神秘。

为了解决这一科学问题，周欢欢等人开展了一项深入的研究，成果发表在《Veterinary Research》上。他们建立了一套体外细胞感染模型，选用猪肾近曲小管上皮细胞LLC-PK1和高致病性的G. parasuis SH0165（血清5型）菌株，通过细胞活性检测、细菌黏附与侵袭实验、扫描与透射电镜观察，以及CRISPR/Cas9基因敲除和转录组测序等技术，系统揭示了RHOA在细菌感染中的新功能。

研究中采用的主要关键技术方法包括：使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RHOA敲除的LLC-PK1细胞系；通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察细菌与宿主细胞的超微结构互动；采用RNA测序（RNA-seq）进行全转录组分析；应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot对关键基因和蛋白表达进行验证；利用Edu增殖实验和Giemsa染色分析细胞增殖与细菌附着情况。

研究结果主要包括以下方面：

Upregulation of RHOA in LLC-PK1 cells infected with G. parasuis

通过建立G. parasuis感染模型，发现细胞存活率随感染时间延长急剧下降，至168小时仅剩约1%。细菌黏附数量随时间推移逐渐增加，电镜结果显示细菌附着于细胞表面并借助伪足样结构侵入细胞。RT-qPCR分析显示感染后12小时和48小时RHOA mRNA表达显著上调，表明RHOA在感染过程中被激活。

Knockout of RHOA enhances host cell survival during lethal G.parasuis infection

成功构建RHOA敲除细胞系后，发现基因敲除并不影响细胞正常增殖。但在G. parasuis感染后，野生型细胞出现严重病变（肿胀、破裂和脱落），而RHOA-KO细胞保持正常形态和活力。Edu阳性细胞数量在敲除组显著增加，细胞存活率从野生型的0.75%大幅提升至77.30%，表明RHOA缺失显著增强宿主细胞对感染的抵抗能力。

Depletion of RHOA reduces G. parasuis adhesion and invasion

Giemsa染色显示RHOA-KO细胞表面附着的细菌数量明显减少。CFU计数结果表明，敲除RHOA后细菌黏附（3-48小时）和侵袭（9-48小时）能力均显著降低，证实RHOA在G. parasuis侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。

Identification of differentially expressed(DE) mRNAs

转录组测序发现RHOA敲除细胞中有1797个差异表达基因，其中1174个上调，623个下调。通过RT-qPCR验证了IFIT1、MYL9、RSAD2、GREM1（下调）和RGS4、ABCA12、CDH1、CLDN1（上调）等关键基因的表达变化，结果与RNA-seq数据高度一致。

Functional annotation of DE mRNAs

GO功能富集分析显示差异基因主要涉及细胞黏附、同源细胞黏附和微管运动等过程。KEGG通路分析表明细胞黏附分子和黏着斑信号通路显著富集。RHOA敲除导致细胞骨架调节因子（ACTG1、MYL7、MYL9）表达下调，而紧密连接成分（CDH1、CLDN1、CDH5）表达上调，表明RHOA通过间接调控细胞骨架重组和细胞连接稳定性影响感染过程。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示了RHOA在G. parasuis感染中的关键作用，证明其作为宿主依赖性因子通过调控细胞骨架重组和紧密连接稳定性促进细菌侵袭。与病毒感染中RHOA功能的双重性不同，在细菌感染中RHOA主要表现为促进入侵的作用。这一发现不仅深化了对G. parasuis致病机制的理解，也为Glasser病的防控提供了新的分子靶点。通过靶向RHOA或其下游信号通路（如RhoA/ROCK/MLC），可能开发出新的疾病干预策略。该研究为猪细菌性疾病的防治提供了重要的理论基础，对促进生猪健康养殖和疾病分子育种具有重大意义。