转铁蛋白敲除揭示大西洋鲑吞噬细胞对杀鲑鱼立克次体的耐受表型及其在疫苗开发中的意义

本刊推荐：为解决杀鲑鱼立克次体(Piscirickettsia salmonis)引发的鲑鱼立克次体败血症(SRS)对智利水产养殖业的严重危害，研究人员开展了针对转铁蛋白(Transferrin, TF)在疫苗诱导保护及宿主-病原互作中作用机制的研究。通过田间试验结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，发现接种含P. salmonis抗原的联合疫苗(SIA组)可显著提高养殖鲑鱼存活率(85% vs 52%)、降低细菌载量，并调控铁代谢基因（如转铁蛋白Tf、铁蛋白Fer、铁调素Hamp等）的表达；体外实验进一步证实TF敲除(TF-KO)的吞噬细胞在感染后呈现细胞病变减轻、存活率提升的耐受表型。该研究揭示了转铁蛋白缺失通过锌结合等金属相关通路（而非铁稳态）介导感染耐受的新机制，为开发抗SRS新型疫苗和靶向策略提供了重要理论依据。

　　

在智利水产养殖业中，由杀鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）引起的鲑鱼立克次体败血症（SRS）一直是一项严峻的挑战，导致巨额经济损失。尽管疫苗接种已成为防控SRS的主要策略，但其对细胞内病原体的长期保护效果及作用机制仍不明确。近年来研究表明，铁代谢在宿主与P. salmonis的相互作用中扮演关键角色——这种细菌具有“嗜铁”特性，尤其偏爱侵袭鲑的头肾（主要造血器官），而宿主则通过调控铁转运蛋白（如转铁蛋白及其受体）、铁储存蛋白（如铁蛋白）和铁调节肽（如铁调素）的表达，限制细菌获取铁元素，从而抑制其复制。不仅如此，铁代谢还深远地影响着先天与适应性免疫应答，例如T细胞增殖与抗体产生均依赖铁元素参与。先前研究报道，接种疫苗后鲑鱼体内铁分布及相关基因表达发生改变，暗示铁稳态、疫苗效能与抗感染能力之间存在密切关联。

为深入探索疫苗接种对SRS防控效果及铁代谢调节的影响，由Madelaine Mejias、Alejandro Saez等研究人员领导团队在真实养殖环境下开展试验，并结合分子生物学与基因编辑技术展开机制研究。相关成果发表在《Veterinary Research》，为抗SRS疫苗研发和宿主-病原互作研究提供了新的视角。

研究主要依托以下几项关键技术方法：首先，在田间试验中，他们对大西洋鲑（Salmo salar）幼鱼进行分组免疫，一组接种五价灭活疫苗加P. salmonis减毒活疫苗（SIA），另一组接种不含P. salmonis抗原的四价疫苗（SS组），追踪41周存活率并采集头肾组织；利用qPCR（定量聚合酶链反应）检测细菌载量和铁代谢基因（Tf、TfR、Fer、Hamp）表达；其次，通过CRISPR/Cas9技术构建转铁蛋白双基因敲除（TF-KO）的鲑头肾来源吞噬细胞系（SHK-1），并与野生型（TF-WT）细胞进行体外感染对比，观察细胞病变、细菌空泡（PCVs）形成和细胞存活率；最后采用RNA-Seq转录组测序分析TF-KO与TF-WT细胞间的差异表达基因，并利用STRING数据库进行功能富集分析，以揭示调控网络和关键通路。所有统计均基于生物学重复，采用Student’s t检验、双因素方差分析（ANOVA）等完成。

疫苗接种与杀鲑鱼立克次体感染显著影响鲑鱼存活、细菌载量及铁代谢基因表达

研究团队发现，在海水转移后28周内，SIA与SS组鲑鱼存活率无显著差异；但至第41周，SIA组存活率显著高于SS组（85% vs. 52%）。同时，qPCR检测显示，自T4时间点起，SS组头肾中P. salmonis载量显著上升，且与死亡率增加趋势一致。值得注意的是，在出现死亡差异前（T1-T4），SIA组多个铁代谢基因表达已发生改变：铁蛋白（Fer）和铁调素（Hamp）在淡水阶段即显著上调，而转铁蛋白（Tf）及其受体（TfR）则在海水阶段表达升高。这些结果提示，疫苗可能通过提前调控铁代谢相关基因，增强宿主对后续感染的防御能力。

转铁蛋白敲除使鲑吞噬细胞对杀鲑鱼立克次体感染呈现耐受表型

为明确转铁蛋白在感染过程中的作用，研究者利用CRISPR/Cas9技术成功构建TF-KO细胞系（突变导致蛋白截断，丧失铁结合能力）。体外感染实验中，与TF-WT细胞相比，TF-KO细胞感染P. salmonis后形成的含菌空泡（PCVs）数量和大小均显著减少，细胞病变效应减轻，存活率显著提高（与未感染组无显著差异）。然而，细菌载量在两组间无差异，且铁代谢基因（Tf、TfR、Fer、Hamp）表达未受突变或感染显著影响（仅TF在感染后表达上升）。这一结果表明，转铁蛋白缺失并未改变细胞内铁稳态，却赋予细胞一种“感染耐受”表型——即细胞在维持病原存在的同时自身损伤减轻。

转录组分析揭示转铁蛋白缺失引发金属结合及锌相关通路富集，与铁代谢无直接关联

通过RNA-Seq比较TF-KO与TF-WT细胞，共发现311个差异表达基因（DEGs），其中142个上调、169个下调。蛋白互作网络分析显示这些基因形成三个模块，涉及金属结合、锌离子结合、转录调控及激酶活性等功能，但未直接关联铁代谢通路。关键节点包括金属响应元件结合转录因子2（MTF2）、AN1型锌指蛋白4类似物（ZFAND4）等锌依赖蛋白，以及下调的RNA结合蛋白EWS类似物（EWSR1）——后者在多种病毒感染中被利用以促进复制。此外，囊主蛋白（MVP）作为上调最显著的基因，此前研究提示其可能与细胞抗感染能力相关。这些发现说明，转铁蛋白缺失可能通过锌离子稳态和转录重编程介导耐受表型，而非通过预期中的铁调节途径。

本研究通过田间试验与体外实验相结合，证实针对P. salmonis的联合疫苗可显著提高鲑鱼存活率并降低细菌负荷，且该保护效应与铁代谢基因的时序性调控密切相关。尤为重要的是，转铁蛋白敲除并未影响细胞内铁稳态或病原复制，却显著增强吞噬细胞对感染的耐受能力——表现为病变减轻、存活率提升。转录组分析进一步表明，这一耐受表型可能与锌结合蛋白、金属响应通路及相关转录因子（如MTF2、ZFAND4）的调控有关，而与经典铁代谢途径无直接联系。该发现不仅揭示了转铁蛋白在抗细胞内病原感染中的新角色，也为开发靶向金属稳态或耐受机制的SRS防控策略（如新型疫苗佐剂或免疫调节剂）提供了重要理论依据。未来研究可深入探索锌离子代谢、囊主蛋白（MVP）等候选分子在感染耐受中的具体功能，从而推动水产养殖中抗病育种和精准免疫干预的发展。