机械力激活snailb基因调控心肌分层起始以促进心室小梁形成机制研究

本研究针对心脏发育过程中机械力如何协调心室小梁起始形成的机制问题，通过整合4-D应变分析、CRISPR基因编辑和单细胞转录组学技术，发现机械力激活的snailb阳性心肌细胞（Notch阴性）独立于经典ErbB2/TGF-β通路，直接介导心肌细胞分层并驱动小梁形成，为左心室致密化不全等先天性心脏病提供了新的力学-遗传学机制见解。

　　

在心脏形态发生过程中，心肌细胞分化为外层致密区和内层小梁区两个部分。心室内心肌形成的网状肌性突起——小梁，对于冠状动脉血管系统完全发育前的血液灌注和心肌收缩功能至关重要。小梁形成减少与先天性心脏缺陷相关，而过度小梁化（又称左心室非致密化，LVNC）则是儿科人群中仅次于扩张型和肥厚型心肌病的第三常见心肌病，其在接受超声心动图检查的成人患者中患病率估计为4.5-26/万例。然而，控制小梁组织起始的机械转导机制仍不清楚。

在斑马鱼模型中，小梁起始是生化信号与机械信号协调互作的结果——心肌收缩力和血流剪切力通过侧向激活/抑制Notch-Nrg1-ErbB2信号通路来调控心肌细胞分层和增殖形成小梁。尽管Snail家族基因（如人类SNAI1）是上皮-间质转化（EMT）的经典转录因子，参与瓣膜形成、组织纤维化和再生过程，但Snail在心室中是否参与小梁组织形成尚属未知。

本研究揭示：在斑马鱼受精后4天（dpf）的心室中，snailb阳性心肌细胞稀疏分布；而异丙肾上腺素（ISO）处理能显著增加snailb阳性心肌细胞数量，其中80%为Notch阴性。CRISPR激活snailb可使51.6%的心肌细胞形成小梁，而CRISPR抑制则在ISO条件下将小梁心肌细胞减少至6.7%。此外，36.7%的snailb抑制心肌细胞发生顶端分层。4-D应变分析表明，ISO能增加沿径向小梁脊分布的心肌应变，该区域与snailb表达及Notch-ErbB2介导的小梁形成区域一致。单细胞和空间转录组学进一步显示，这些snailb阳性心肌细胞缺乏某些EMT相关表型（如Colla2产生、ErbB2或TGF-β诱导）。因此，本研究发现了机械力激活的snailb阳性心肌细胞通过启动分层来协调心脏小梁形成的新机制。

研究人员主要采用以下关键技术方法：利用转基因斑马鱼系（Tg(snai1b:EGFP;myl7:mCherry)等）进行活体成像；应用异丙肾上腺素（ISO）和多种抑制剂（PD168393、LY364947等）进行药理干预；通过心肌特异性Tol2-CRISPR激活/抑制系统进行snailb功能增益/缺失研究；采用4-D旋转盘荧光成像和应变映射技术分析心肌变形；结合全mount荧光原位杂交（FISH）、单细胞RNA测序和空间转录组学进行分子表型解析。

snailb阳性心肌细胞的机械敏感性

在56 hpf至6 dpf期间，snailb在胚胎心肌中稀疏表达，但在球室环（BV annulus）区域显著富集。ISO处理（1 dpf开始）通过增加心肌收缩力和心室应变，使小梁形成期间snailb阳性心室心肌细胞数量显著增加。至14 dpf，对照组snailb阳性心肌细胞仍稀疏分布，而ISO处理组则形成连续的小梁网络。4-D应变映射显示，ISO处理使心肌平均“面积应变”增加，且应变变化在小梁层比致密层更为显著。

心肌应变与径向小梁脊排列一致

ISO诱导的心肌应变与三维小梁组织排列一致：径向小梁脊在收缩期应变增加31.6%，而周向脊应变无显著变化。二维截面显示径向小梁脊在收缩期经历跨壁增厚（伸长），而周围致密层发生周向收缩。ISO使径向小梁脊的跨壁应变增加136%，致密层周向应变不变。这些结果表明小梁心肌细胞沿纤维方向比致密心肌细胞承受更高应变。

snailb阳性/Notch阴性心肌细胞启动分层

小梁起始阶段，Notch激活与抑制共同调控小梁脊与沟的形成。在对照组和ISO处理组中，小梁心肌细胞缺乏Notch活性，而相邻心肌细胞则Notch阳性。83%的ISO处理snailb阳性心肌细胞为Notch阴性，且部分发生顶端分层。ErbB2抑制剂（PD168393）处理虽损害小梁形成，但不影响snailb阳性心肌细胞总数，且87.7%仍为Notch阴性，表明心肌snailb激活独立于内皮剪切应力及Notch介导的ErbB2信号。

激活心肌snailb启动分层

利用心肌特异性Tol2-CRISPR激活/干扰系统证实：ISO处理后，snailb激活显著增加分层和小梁心肌细胞比例（51.6%），而抑制snailb则使36.7%心肌细胞发生顶端分层。这表明snailb在机械应变下协调小梁的适当分层。

snailb阳性心肌细胞中间充质基因富集

单细胞RNA测序分析显示，snailb阳性心肌细胞位于球室环集群，富集间充质基因（如tgfbr2b、f2b）和细胞外基质（ECM）基因（胶原蛋白、dcn、lama5），但缺乏肌节结构、钙处理和电子传递机制相关基因，表明其表现向间充质样转化。然而，这些细胞不表达colla2，且不受TGF-β或ErbB2信号调控，提示其具有独特的非经典EMT转录组特征。

snailb在心心肌细胞与心外膜/瓣膜细胞的通路差异

虽然colla2 mRNA与snailb在心外膜细胞和瓣膜间质细胞中共定位，但心肌snailb阳性细胞不表达colla2。TGF-β信号抑制剂（LY364947）处理虽损害小梁形成，但不影响snailb表达，进一步表明心肌snailb规避了调控其他Snail基因（如twist1b、snai2）的主调控因子（TGF-β、ErbB2）。

本研究通过多学科方法验证了机械应变激活的心肌snailb表达在启动小梁分层中的核心作用，揭示了独立于经典Notch-ErbB2通路的力学-遗传新机制。这些发现为理解心脏形态发生提供了新的力学生物学视角，并为左心室非致密化等先天性心脏病的机制研究与靶点干预提供了潜在方向。