皮肤疾病非编码调控变异与稳态转录因子在表皮中的功能解析

本研究针对多基因皮肤疾病中非编码单核苷酸变异(SNV)如何通过调控转录因子(TF)结合影响基因表达这一关键问题，通过大规模并行报告分析(MPRA)、CRISPR筛选和群体采样CUT&RUN等技术，系统鉴定了355个差异活性SNV(daSNV)和123个表皮稳态必需TF，揭示了AP-1/2和SP/KLF家族转录因子在介导疾病风险变异与表皮分化/炎症基因调控之间的核心作用，为理解多基因皮肤疾病的分子机制提供了重要资源。

　　

皮肤是人体最大的器官，也是多种常见疾病的发生场所，从炎症性的银屑病、特应性皮炎到肿瘤性的基底细胞癌和鳞状细胞癌，这些多基因皮肤疾病共同影响着全球数亿人口的健康。尽管全基因组关联研究(GWAS)已经识别出大量与疾病风险相关的遗传变异，但其中绝大多数位于非编码区域，它们如何影响基因表达、最终导致疾病的分子机制仍然是个"黑箱"。特别值得注意的是，这些疾病都表现出表皮稳态的破坏——即皮肤基底层干细胞增殖与终末分化之间的平衡失调，但这种失调究竟是疾病的起因还是后果，科学界一直存在争议。

为了解开这个谜团，斯坦福大学医学院Paul A. Khavari团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究人员整合了多种前沿技术手段，试图系统性地回答三个关键问题：哪些疾病相关的非编码变异真正具有调控功能？哪些转录因子对表皮稳态至关重要？这些变异如何通过影响转录因子结合来调控基因表达？

研究人员首先从57项GWAS研究中收集了852个与多基因皮肤疾病相关的lead SNV，通过连锁不平衡分析扩展到26,278个SNV，并利用表皮角质形成细胞的开放染色质数据筛选出3,451个可能具有调控功能的SNV。他们采用大规模并行报告分析(MPRA)技术，将这些变异克隆到报告基因上游，在体外模拟角质形成细胞分化过程（未分化状态、早期分化和晚期分化）中测试它们的转录调控活性。

研究发现，转录活性在分化过程中呈现动态变化，主成分分析(PCA)能够清晰区分不同分化时间点的样本。特别有趣的是，当敲除关键转录因子IRF6（促进分化）或SNAI2（维持祖细胞状态）后，MPRA活性在PCA空间中的分布会沿着分化轴移动，说明这种分布确实反映了生物学状态而非技术误差。

研究人员最终鉴定出355个差异活性SNV(daSNV)，这些变异在不同分化时间点表现出等位基因特异性的转录调控活性。 motif分析显示，daSNV显著富集于AP-1、KLF4、SP1、TFAP2A等已知表皮稳态转录因子的结合 motif，提示这些TF可能介导了疾病变异的功能效应。

为了系统鉴定表皮稳态必需的转录因子，研究人员开展了CRISPR-flow筛选，针对1,772个人类TF基因，在原发性人角质形成细胞中评估它们对分化标志物KRT10表达的影响。通过流式细胞分选KRT10高、中、低表达的细胞群体并测序分析sgRNA的富集情况，他们发现了一系列对表皮稳态至关重要的TF。

为了获得更全面的基因表达信息，研究人员进一步进行了单细胞扰动测序(perturb-seq)，针对502个表皮表达的TF基因，在角质形成细胞分化过程中进行敲除并分析全转录组变化。通过分析约27.5万个单细胞转录组，他们构建了细胞分化的伪时间轨迹，并评估了每个TF敲除对分化进程的影响。

整合CRISPR-flow和perturb-seq数据，研究人员最终确定了123个表皮稳态必需TF，其中包括已知的关键因子如IRF6、SNAI2、TP63等，也发现了新的重要因子如ZNF217和CXXC1。特别值得注意的是，AP-1和SP/KLF家族的TF在两种筛选中都显示出最强的影响效应，与MPRA的motif分析结果高度一致。

为了深入了解这些转录因子如何与疾病变异相互作用，研究人员对27个稳态TF进行了群体采样CUT&RUN分析，在12个个体的原代角质形成细胞中绘制了它们在不同分化状态下的全基因组结合图谱。这一分析产生了298个高质量的数据集，其中15个TF此前从未在人类角质形成细胞中进行过全基因组结合分析。

通过分析 heterozygous SNV 位点的等位基因特异性结合(ASB)，研究人员发现了2,980个潜在的ASB事件，其中298个为高置信度ASB。值得注意的是，启动子区域的ASB效应显著弱于增强子区域，表明启动子对DNA序列变异具有"缓冲"效应。这种缓冲效应可能与启动子区域TF结合密度较高有关，多个TF的协同结合可能降低了个别结合位点对序列变化的敏感性。

ASB事件显著富集于表皮分化基因和单基因皮肤疾病基因附近，如JUN、SP3和TFAP2A等TF的结合位点。更重要的是，ASB与MPRA中的转录活性变化显著相关（如JUN的ASB与MPRA活性相关性R=0.38, P=0.001），说明这种结合差异确实具有功能效应。

研究人员还通过CRISPR-Cas9和AAV介导的同源定向修复技术，对几个重要的daSNV进行了基因组编辑，在原代角质形成细胞中验证了它们对靶基因表达的调控作用。例如，rs72696969（与特应性皮炎相关）的风险等位基因降低了FLG基因的表达；rs2349075（与基底细胞癌相关）的风险等位基因破坏了AP-1 motif，降低了JUN/JUNB结合和CASP8表达；rs4704864（与银屑病相关）的风险等位基因破坏了AP-1 motif，降低了NIPAL4表达。这些实验为疾病变异的功能提供了直接证据。

本研究的主要技术方法包括：从57项GWAS研究收集852个lead SNV并扩展到26,278个SNV；利用ATAC-seq和组蛋白修饰数据筛选出3,451个可能具有调控功能的SNV；采用MPRA技术在体外分化模型中测试SNV的转录调控活性；使用CRISPR-flow筛选1,772个TF基因对表皮分化的影响；通过perturb-seq分析502个TF敲除的单细胞转录组响应；对27个稳态TF进行群体采样CUT&RUN，在12个个体的原代角质形成细胞中绘制全基因组结合图谱；利用CRISPR-Cas9和AAV介导的同源定向修复对重要daSNV进行功能验证。

Regulatory variants linked to skin disease 研究人员通过MPRA技术分析了3,451个与皮肤疾病相关的SNV，发现它们的转录调控活性在角质形成细胞分化过程中呈现动态变化。主成分分析显示不同分化状态的样本能够清晰区分，且关键转录因子敲除后样本在PCA空间中的分布会沿分化轴移动。研究最终鉴定出355个daSNV，这些变异显著富集于AP-1、KLF4、SP1、TFAP2A等已知表皮转录因子的结合motif。

TF motifs and interactions disrupted in daSNVs motif分析显示，daSNV破坏的motif主要属于AP-1、SP/KLF和AP-2家族，提示这些转录因子家族在介导疾病风险变异的功能效应中起关键作用。研究人员通过基因组编辑验证了几个重要daSNV的功能，如rs72696969风险等位基因降低FLG表达，rs2349075风险等位基因破坏AP-1 motif并降低CASP8表达。

Disease-linked SNV putative target gene network daSNV的潜在靶基因网络分析显示，这些基因显著富集于表皮分化和炎症相关通路。许多靶基因的编码突变已知会导致单基因皮肤疾病，如FLG（鱼鳞病）、CDSN（剥脱性皮肤综合征）等，提示多基因疾病风险可能部分通过调控这些关键基因的表达来实现。

CRISPR knockout screen for TFs that modulate epidermal differentiation 通过CRISPR-flow筛选，研究人员发现了一系列对表皮分化至关重要的TF。已知因子如IRF6（促分化）和SNAI2（维持祖细胞状态）显示出预期的效应，同时也发现了新的重要因子如ZNF217和CXXC1。

Perturb-seq screen for TFs that modulate epidermal homeostasis 单细胞perturb-seq分析进一步证实了CRISPR-flow的结果，并提供了更全面的基因表达信息。分析显示，不同TF敲除会导致细胞在分化轨迹上不同位置的富集，反映了它们对分化过程的不同影响。

Global occupancy patterns of 27 homeostatic TFs across epidermal differentiation 对27个稳态TF的CUT&RUN分析揭示了它们在全基因组范围内的结合模式。研究发现这些TF的结合显著富集于表皮分化基因和单基因皮肤疾病基因附近，且皮肤疾病相关的SNV比其它疾病SNV更可能被这些TF结合。

Population sampling CUT&RUN identifies allele specific binding 群体采样CUT&RUN分析发现了2,980个潜在的等位基因特异性结合事件，其中298个为高置信度ASB。这些ASB显著富集于表皮稳态基因附近，且与MPRA中的转录活性变化相关，支持它们的功能重要性。

ASBs and transcriptional effects 分析显示，ASB与MPRA中的转录活性变化显著相关，特别是对于JUN和SP/KLF家族TF。研究人员还发现了启动子区域对ASB的"缓冲"效应，这可能与启动子区域TF结合密度较高有关。

本研究通过整合多种高通量技术，系统性地解析了多基因皮肤疾病中非编码变异的功能机制。研究发现，疾病风险变异通过影响AP-1/2和SP/KLF等关键转录因子家族的结合，调控表皮分化和炎症相关基因的表达，从而破坏表皮稳态并导致疾病发生。这些发现不仅深化了我们对多基因疾病发病机制的理解，也为未来开发新的治疗策略提供了重要靶点和资源。

研究的创新之处在于将变异功能分析、必需基因筛选和TF结合图谱有机整合，提供了从序列变异到功能效应的完整视角。特别是群体采样CUT&RUN的方法，能够在群体水平上检测等位基因特异性结合，为理解遗传变异的功能机制提供了强大工具。

需要注意的是，本研究主要关注了表皮角质形成细胞，而多基因皮肤疾病通常涉及多种细胞类型（如免疫细胞、成纤维细胞等）的相互作用。未来的研究需要扩展到这些细胞类型，才能更全面地理解疾病机制。

总之，这项研究为我们理解非编码变异如何通过影响转录因子结合来调控基因表达、最终导致疾病提供了重要框架和资源，对未来精准医学研究和治疗策略开发具有重要意义。