利用CRISPR筛选平台CELLFIE系统发现增强CAR-T细胞免疫疗法的新策略

为解决CAR-T细胞功能障碍导致的治疗失败问题，奥地利研究团队开发了CRISPR筛选平台CELLFIE，通过全基因组筛选发现RHOG和FAS基因敲除可显著增强CAR-T细胞抗肿瘤活性，并在多种体内模型中验证其协同增效作用，为优化细胞免疫疗法提供了重要资源。

　　

在癌症治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已经取得了革命性的突破，特别是在血液肿瘤治疗中显示出显著成效。然而，这种疗法仍然面临一个主要挑战：CAR-T细胞功能障碍常常导致治疗失败。这种功能障碍表现为多种形式：T细胞适应性和增殖能力有限、预处理的癌症患者体内T细胞数量不足、慢性CAR刺激导致的细胞耗竭、免疫抑制和营养匮乏的肿瘤微环境，以及当CAR-T细胞通过 trogocytosis 从靶细胞获取抗原时发生的 fratricide（自相残杀）现象。

与传统T细胞经过进化优化不同，CAR-T细胞是细胞工程的产物，缺乏进化优化过程。因此，某些对T细胞功能至关重要的基因可能反而会损害CAR-T细胞的治疗潜力。这一概念得到了临床观察的支持：一名白血病患者体内TET2缺陷的CAR-T细胞克隆取得了出人意料的成功，以及多项研究表明基因扰动可以增强CAR-T细胞性能，例如通过敲除免疫检查点基因（PD-1和CTLA-4）、表观遗传调节因子（PRDM1）、信号蛋白（RASA2）和介质亚基（CCNC），或通过过表达转录因子（c-Jun和FOXO1）。

考虑到CAR-T细胞是基因工程的医疗产品，CRISPR筛选提供了一个天然且临床可转化的策略来优化和适应各种应用。随着人类原代T细胞遗传筛选技术的最新进展，研究人员提出假设：具有临床相关读数的全基因组筛选能够实现CAR-T细胞的人工进化，以识别能够增强其效力的遗传扰动。

为了支持CRISPR增强的CAR-T细胞免疫疗法的系统发现，奥地利科学院分子医学研究中心的Paul Datlinger、Eugenia V. Pankevich和Cosmas D. Arnold等研究人员开发了CELLFIE平台，用于人类原代CAR-T细胞的高通量CRISPR筛选。这项研究于2025年9月24日发表在《Nature》杂志上。

研究人员通过几个关键技术方法开展研究：首先开发了CROP-seq-CAR载体，用于共递送CAR和gRNA文库；使用mRNA技术递送CRISPR编辑器，避免低效的慢病毒生产和大型转基因的递送；建立了基于荧光激活细胞分选（FACS）的筛选读数，涵盖靶细胞识别、T细胞活化、细胞凋亡和fratricide以及细胞耗竭等关键生物学过程；创建了体内CROP-seq方法，支持在白血病异种移植模型中进行混合筛选；还进行了组合CRISPR筛选以识别协同基因对，并进行饱和碱基编辑筛选以表征RHOG变异。

研究结果方面，通过基因组规模的CAR-T细胞适应性筛选，研究人员发现了一系列能够改善CAR-T细胞功能的基因敲除。筛选结果重现了CAR-T细胞的重要内在局限性：CAR刺激下的扩增速度比TCR刺激慢，与CAR信号传导的有效性较低一致；在CAR-T细胞上检测到高水平的CD19抗原，这可以通过从靶细胞通过trogocytosis获取膜成分来解释，导致其他CAR-T细胞的杀伤（fratricide）；CAR-T细胞上调了某些T细胞耗竭标志物，包括PD-1、LAG3、TIM3和TIGIT，这与较差的临床性能相关。

通过FACS筛选鉴定调控关键生物学过程的基因，研究人员建立了四种生物学过程的筛选读数：通过测量CAR-T细胞从靶细胞通过trogocytosis摄取的CD19量作为累积靶细胞识别的标志物；使用CD69表达作为T细胞活化的标志物，筛选具有更高CAR信号传导或减少负调控的T细胞；使用FAS表达（在TCR刺激后显著上调）来识别减少CAR-T细胞治疗中细胞凋亡和fratricide有害影响的敲除；使用组合的PD-1、LAG3和TIM3读数来筛选早期耗竭的调节剂。

体内CROP-seq筛选验证CAR-T细胞增强因子是研究的另一个重要部分。研究人员开发了新的体内CROP-seq方法，用mRNA读数替代DNA读数，利用含有gRNA的mRNA的高拷贝数。通过这种方法，他们在20只小鼠中测试了39个扰动，与逐一验证相比，动物数量减少了约20倍。使用UMI进行克隆分析，他们检测到每个供体有数千个独立的CAR-T细胞克隆，表明强大的植入性和足够的筛选覆盖范围。

RHOG和FAS敲除增强体内疗效是研究的核心发现。研究人员发现RHOG敲除CAR-T细胞实现了显著的白血病细胞清除和持续反应，在所有体内验证中与标准CAR-T细胞相比显著延长了生存期。RHOG敲除和FAS敲除的组合产生了高度协同效应，在故意非治愈性的异种移植模型中显著改善了肿瘤控制和长期缓解。

RHOG影响增殖和持久性的机制研究表明，RHOG敲除CAR-T细胞在反复暴露于CD19阳性癌细胞10天后，显示出更高的CD62L⁺CD45RO⁺细胞比例，表明向中央记忆表型的转变，这可能有助于其观察到的增殖优势。RNA测序揭示了涉及DNA复制和细胞周期、核糖体代谢和蛋白质翻译的基因上调。这些变化伴随着后期S期标志基因的表达升高，与慢性刺激期间的持续增殖一致。

组合筛选协同基因方面，研究人员将组合筛选整合到CELLFIE平台中，通过调整CROPseq-multi技术和开发CROP-seq-CAR-multi载体，用于从单个转录本递送两个gRNA，由内源性tRNA处理系统切割的tRNA序列分隔。他们选择了六个基因（FAS、RHOG、PRDM1、CDKN2A、HAVCR2和CTLA4）以及三个必需基因和安全港位点对照，并设计了一个双gRNA文库，覆盖每基因两个gRNA的所有238对组合。

碱基编辑用于临床转化的研究显示，研究人员进行了RHOG的饱和诱变，以鉴定关键氨基酸并优先选择碱基编辑gRNA用于临床。他们准备了一个包含3,755个碱基编辑gRNA的筛选文库，对RHOG（1,169个gRNA）和嘌呤霉素抗性基因PAC（1,140个gRNA）的基因体进行密集覆盖，并包括靶向必需基因（阳性对照）和安全港位点（阴性对照）的gRNA。通过绘制碱基编辑gRNA沿蛋白质序列的富集或耗竭，他们可以定位功能上重要的氨基酸。

研究结论和讨论部分强调，CELLFIE提供了一个系统性的、基于筛选的细胞疗法优化蓝图，可能有助于实现细胞作为灵活、情境反应性和基因可编程治疗剂的巨大潜力。RHOG敲除是一个特别引人入胜的发现，强调了全基因组筛选的价值。之前与人类单基因免疫缺陷相关的RHOG是一个不太可能的候选者，但在体外和体内筛选中是一个强效的hit。RHOG敲除CAR-T细胞显示出增强的增殖、优先的记忆细胞分化和减少的耗竭。另一个筛选hit——FAS敲除，通过减少细胞凋亡和增强存活提供了互补的好处。RHOG和FAS敲除的组合产生了高度协同效应，显著改善了肿瘤控制和长期缓解。

这项研究的核心创新在于建立了集成平台，支持原代免疫细胞中的CAR-T细胞工程和CRISPR筛选，实现全基因组发现、体内混合验证、组合敲除筛选和碱基编辑用于临床前开发。该平台使研究人员能够创建CAR-T细胞中CRISPR筛选的主要资源，基于此确定了多个能够增强CAR-T细胞性能的基因编辑，最终发现RHOG敲除作为有效的CAR-T细胞增强剂。

研究人员能够 across 四种CAR设计、两种肿瘤模型和多个T细胞供体（包括一名计划接受CAR-T细胞治疗的患者）验证他们的发现。在更高剂量下，RHOG敲除CAR-T细胞在该模型中也具有治愈性。长期随访（长达392天）显示CRISPR增强的CAR-T细胞没有恶性转化的迹象。

研究表明，将RHOG和FAS敲除相结合的方法 exemplifies 了一种模块化的CAR-T细胞工程方法，其中不同的扰动可以组合成定制的治疗设计。为了系统发现这样的敲除对，研究人员将组合CRISPR筛选集成到CELLFIE平台中，并进行了一个概念验证筛选，验证了他们的发现，即基因敲除的组合可以显著增强CAR-T细胞性能，远超任何单一敲除的效果。

最后，研究人员使用碱基编辑在RHOG序列上进行覆盖筛选，以 mapping 那些对RHOG抑制CAR-T细胞效应至关重要的基因部分，并支持选择碱基编辑gRNA用于未来的临床开发。

总之，这项工作建立了系统性、基于筛选的细胞疗法优化蓝图，可能有助于实现细胞作为灵活、情境反应性和基因可编程治疗剂的巨大潜力。研究人员提供的开源试剂和详细协议将使许多实验室能够进行此类筛选，推动细胞免疫治疗领域的进一步发展。