基于TSA/CRISPR一体化检测系统的高风险动物源传染病快速诊断技术研究

本文针对等温扩增POCT技术存在的引物设计复杂和假阳性率高等问题，推荐研究人员开发了一种集恒温扩增（TSA）与CRISPR检测于一体的单管快速诊断系统（TCOPS）。该系统可同步检测SARS-CoV-2、MPXV及RV病毒，灵敏度达10 copies/μL，临床验证显示>90%灵敏度与100%特异性，为现场快速检测提供了关键技术支撑。

　　

自2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情爆发以来，快速、便捷的病原体检测技术的重要性日益凸显。现场即时检测（Point-of-care testing, POCT）能够在采样现场直接提供快速诊断结果，极大提升了疫情防控效率。然而，基于等温扩增的POCT技术仍面临引物设计复杂、假阳性率高等技术挑战。为了突破这些限制，研究人员开发了一种集恒温步进扩增（Thermostatic Step Amplification, TSA）与规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）技术于一体的一站式检测系统——TCOPS（TSA/CRISPR One-Pot System），为实现高风险动物源传染病的快速、精准检测提供了全新解决方案。

该研究发表于《Journal of Microbiological Methods》，由Zhenghua Gong、Tian Lu、Zhouxi Ruan、Rongrong Zhang、Songqi Zhu、Zhenyao Xia、Jianfeng Zhong、Guilan Wang、Yingxin Li、Qian He、Rongqi Liu及Jun Che共同完成。研究团队来自深圳市研源生物科技有限公司（Shenzhen Yanyuan Biotechnology Co, Ltd.），地处中国深圳市。

为开展本研究，作者主要采用了以下几项关键技术：恒温步进扩增（TSA）技术用于靶标核酸扩增；CRISPR-Cas系统用于特异性序列识别与信号放大；qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）作为对比方法进行临床样本验证；冻干试剂制备工艺以实现试剂的常温稳定保存；自主研发的微型荧光检测系统（Q max）用于现场荧光信号采集。临床样本来源于50例真实病例，涵盖SARS-CoV-2、Mpox病毒（MPXV）及狂犬病病毒（RV）的检测需求。

研究结果部分主要包括以下内容：

灵敏度与特异性评价

通过使用克隆DNA模板进行检测，TCOPS对RV的检测灵敏度达到10 copies/μL。在50例临床样本中，与qPCR方法对比，TCOPS表现出超过90%的灵敏度和100%的特异性，表明其具备高度的检测准确性与可靠性。

单管反应体系的优化

TCOPS通过将恒温扩增与CRISPR检测步骤整合于单一反应管中，显著减少了操作步骤和交叉污染风险。该设计不仅提高了检测的可操作性，也增强了现场应用的可行性。

便携式检测系统与冻干试剂的应用

结合Q max便携荧光检测设备与冻干试剂盒，TCOPS实现了多种人畜共患病毒（包括SARS-CoV-2、MPXV和RV）的简单、快速、现场化检测。该系统在资源有限的环境中仍能保持高性能，体现了良好的实用性与适应性。

研究结论与讨论部分强调，TCOPS作为一种整合性分子诊断平台，有效解决了传统POCT技术在引物设计、操作复杂度和假阳性控制方面的局限。其单管反应设计不仅简化了操作流程，也大幅提高了检测的稳定性和重复性。此外，该系统的成功开发为下一代现场即时检测技术提供了可推广的原型，特别是在应对新发突发传染病疫情和偏远地区疾病监控方面具有重要的实践意义。

本研究通过技术创新与系统整合，为高风险动物源性传染病的快速诊断提供了高效、可靠的解决方案，展现了良好的应用前景与社会价值。