全基因组CRISPR/Cas9筛选揭示COMMANDER回收复合体在细胞外囊泡摄取中的关键作用

本研究发现COMMANDER复合体（包含COMMD2/3/5/8/10、CCDC22/93、VPS35L等组分）通过调控细胞表面受体（如整合素α5β1）的回收表达，显著影响细胞外囊泡（EV）的内吞过程。研究采用全基因组CRISPR筛选（GWC）技术，结合流式细胞术（如Alexa 633 C5-Maleimide标记EV）和活细胞成像（如CFSE标记腔内蛋白），揭示了该复合体在EV摄取早期及后期货物分选中的双重功能，为EV介导的细胞间通信机制提供了新见解。

　　

探索细胞外囊泡摄取的分子机制：全基因组遗传筛选

细胞外囊泡（EV）作为细胞间通信的重要媒介，在生理和病理过程中均发挥关键作用。它们通过调节靶细胞的代谢、表观遗传学、分化及运动性等过程，影响组织稳态。EV的摄取是一个主动过程，涉及多种内吞途径，如吞噬作用、巨胞饮作用、网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用以及凝集素依赖的内吞作用。这些机制取决于受体细胞的状态（如代谢、分化和分裂）以及EV的组成和来源。尽管已有研究揭示了EV摄取的多样性，但调控其选择性和特异性的分子机制仍不清楚。

为了系统性、无偏地识别调控EV内化的关键分子，本研究采用了全基因组CRISPR/Cas9（GWC）筛选技术。该方法通过在K562细胞中使用覆盖整个人类基因组的sgRNA文库，结合高通量测序（NGS）分析，旨在发现影响EV摄取的候选基因。研究使用从SKMEL147人黑色素瘤细胞系分离的EV，通过Alexa633-C5-Maleimide标记，并与CRISPR文库细胞共孵育，随后通过流式细胞术分选高荧光和低荧光群体，并进行测序分析。

COMMANDER复合体成为筛选中的显著靶点

筛选结果显示，在低荧光群体中，多个COMMANDER复合体成员（如COMMD2、COMMD3、COMMD5、COMMD8、COMMD10、CCDC22、CCDC93和VPS35L）的sgRNA显著富集。该复合体由CCC复合体和Retriever复合体两个多聚亚复合体组成，主要参与内膜系统的逆行运输途径。此外，筛选还发现了与回收活动相关的其他分子，如Rab7效应因子WDR91和WASH复合体亚基FAM21A，以及自噬调节因子AMBRA1。

基因集富集分析（GSEA）进一步揭示了与肌动蛋白成核、细胞内运输（如早期内体到高尔基体运输）、钙调节胞吐作用等通路相关的基因富集。这些发现表明，COMMANDER复合体在EV摄取中扮演了核心角色。

COMMANDER复合体通过调控质膜受体表达影响EV摄取

为了验证筛选结果，研究在K562和HeLa细胞中构建了多个COMMANDER复合体成员的敲除（KO）细胞系，并通过Western blot验证了蛋白表达水平。结果显示，COMMD5或COMMD10的缺失会影响整个复合体的稳定性，而CCDC93的敲除则未显著影响其他组分。

功能实验表明，COMMANDER复合体缺失会显著降低EV的摄取效率，这一现象在使用不同来源（如黑色素瘤或乳腺癌细胞系）的EV时均得到验证。进一步机制研究发现，COMMD5 KO细胞表面多种整合素（如α5β1、α2β1、α3β1）和ALCAM的表达水平下降，而ICAM-1等受体的表达未受影响。此外，CD63的表面表达也降低，提示细胞外排和回收速率减缓。

COMMANDER复合体调控早期内体分布及EV货物命运

通过共聚焦显微镜分析，研究发现COMMD5 KO细胞的早期内体数量减少、体积增大，并倾向于在核周区域聚集。溶酶体追踪实验进一步显示，KO细胞中酸性内体 compartments 增加，表明内体成熟过程受到影响。

活细胞时序成像实验使用双标记EV（膜蛋白标记Alexa633，腔内蛋白标记CFSE）追踪EV在细胞内的动态过程。结果显示，COMMD5 KO细胞与EV的相互作用减少，且EV在细胞内的运动轨迹缩短。值得注意的是，腔内信号（CFSE）的消失速度远快于膜信号（Alexa633），提示EV可能与内体膜发生融合，导致腔内货物释放到细胞质中。

为进一步解析膜货物和腔内货物的命运差异，研究进行了动力学流式分析。结果显示，在COMMD5 KO细胞中，膜信号在整个实验过程中持续较低，而腔内信号在2小时后逐渐恢复，甚至在6小时后超过对照组。这表明两种货物在内吞后发生解耦，COMMANDER复合体可能参与调控EV货物的分选和递送过程。

讨论与展望

本研究通过全基因组CRISPR筛选，首次系统性揭示了COMMANDER复合体在EV摄取中的关键作用。该复合体通过调节细胞表面受体（如整合素）的回收表达，影响EV的内吞效率。此外，复合体还参与早期内体形成、内体成熟及货物分选等过程。

这些发现不仅深化了对EV介导的细胞间通信机制的理解，也为EV-based therapeutics（如药物递送系统）的优化提供了新靶点。未来研究可进一步探索COMMANDER复合体在特定疾病模型（如癌症、神经退行性疾病）中的功能，以及其作为治疗靶点的潜在价值。