利用CRISPR-Cas9技术在CB6胚胎中构建Ym1缺陷小鼠模型揭示几丁质酶样蛋白功能与基因复制复杂性

为解决几丁质酶样蛋白（CLPs）功能研究中因基因复制导致的靶向难题，研究团队通过CRISPR-Cas9技术在CB6混合背景胚胎中成功构建Ym1（Chil3）缺陷小鼠模型。该模型通过流式细胞术、ELISA和免疫荧光验证Ym1蛋白完全缺失，且相关基因Chia、Chil1和Chil4表达未受影响。这一模型为解析CLPs在稳态和病理过程中的作用提供了关键工具，并为存在拷贝数变异的基因靶向提供了新策略。

　　

几丁质酶样蛋白（Chitinase-like proteins, CLPs）作为糖苷水解酶18家族成员，在稳态维持和疾病进程中扮演着重要角色。这类蛋白由活性几丁质酶进化而来，虽失去几丁质降解能力，但仍能结合几丁质，并在2型炎症（如哮喘和线虫感染）中高度表达。人类CLPs如YKL-40（CHI3L1）已被提议作为多种疾病严重程度的生物标志物，而小鼠中的Brp39（Chil1）、Ym1（Chil3）和Ym2（Chil4）也在多种病理模型中上调。然而，由于C57BL/6背景小鼠近期基因复制事件导致Chil3和Chil4基因座复杂性，阻碍了Ym1和Ym2的功能研究。这两个基因位于3号染色体上相邻位置，蛋白序列相似性高达91%，使得特异性靶向和研究变得困难。

为了破解这一难题，研究团队在《Transgenic Research》发表论文，报道了利用CRISPR-Cas9技术在CB6（C57BL/6 × BALB/c）混合背景胚胎中成功构建Ym1缺陷小鼠模型。这一研究不仅提供了研究CLPs功能的关键工具，所采用的遗传操作策略也为其他存在拷贝数差异的基因靶向提供了借鉴。

研究采用的主要技术方法包括：基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术，设计特异性sgRNA靶向Chil3基因；利用数字PCR（ddPCR）技术验证基因拷贝数变异；通过流式细胞术、ELISA和免疫荧光技术验证蛋白表达；采用快速回交（speed congenics）技术将突变小鼠回交到BALB/c背景；使用免疫组化和分子生物学方法分析基因和蛋白表达。

Generation of a Ym1 deficient mouse utilising CRISPR-Cas9 in CB6 embryos

研究人员最初尝试在C57BL/6J小鼠中使用CRISPR-Cas9系统构建条件性Chil3敲除模型，但由于该品系CLP基因座存在复制（Chil3和Chil4拷贝数为4），导致编辑效率低且出现共分离的等位基因。通过ddPCR验证，发现BALB/c小鼠缺乏这种复制，遂转向BALB/c胚胎。然而BALB/c胚胎存活率低，最终采用CB6混合背景胚胎，成功获得Chil3基因完全缺失的 founder 小鼠。

Identification of coinherited alleles and gene duplication of the CLP locus

基因分型显示编辑事件共分离，ddPCR证实C57BL/6J中Chil3和Chil4拷贝数增加，而BALB/c中为单拷贝。这解释了CRISPR靶向的困难，并与既往报道的C57BL/6品系复制事件一致。

Utilising mixed background CB6 mice to generate a Chil3 deficient mouse

研究人员在CB6胚胎中使用sgRNA和单链ODN修复模板，成功删除Chil3基因。通过株系特异性SNP分析，证实缺失的是BALB/c等位基因。回交和ddPCR验证Chil3拷贝数为1，而Chia、Chil1和Chil4拷贝数未变。

Speed congenics allows rapid backcrossing of CB6 pups to common lab strains

为获得遗传背景一致的小鼠，使用Transnetyx基因监测服务通过SNP面板进行快速回交，在5代内将Chil3缺失小鼠稳定到BALB/c背景。

Chil3-deficient animals do not express Ym1 but show no change in related CLPs

在naive小鼠肺中，Chil3 mRNA和Ym1蛋白在野生型中易检测，纯合子中完全缺失，杂合子中中等表达。免疫荧光和流式细胞术验证肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中Ym1表达缺失，但细胞数量无变化。相关基因Chia和Chil1表达未受影响。

研究结论与讨论强调，C57BL/6小鼠中CLP基因座的复制是遗传靶向的主要障碍，而采用CB6混合背景结合快速回交成功解决了这一问题。所构建的Ym1缺陷小鼠不表达成熟Ym1蛋白，且不影响其他CLPs，为研究Ym1在疾病病因和发病机制中的特异性作用提供了独特工具。由于人类YKL-40与小鼠Ym1功能相似，该模型有助于揭示CLPs在人类疾病中的机制，评估其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。研究还提示，不同近交系小鼠的遗传差异可能显著影响实验结果，强调根据实验室动物遗传报告（LAG-R）框架详细记录小鼠亚系的重要性。未来研究应聚焦于所有小鼠CLPs（Brp39、Ym1和Ym2）的功能，并与人类数据关联，以建立可靠的转化假设。