综述：基于核酸探针的基因点突变检测技术进展：综述

《Frontiers in Chemistry》：Advances in nucleic acid probe-based detection of gene point mutations: a review

基因点突变检测技术综述了酶辅助（CRISPR-Cas9、Ago蛋白）、纳米材料（AuNPs、QDs、SERS）、核酸类似物（PNA、LNA）及纯探针方法（HCR、TSCP）的应用进展，分析了各技术的优势与局限，并探讨了人工智能在探针设计、信号解析及临床转化中的潜力。

　　基因突变是遗传学研究中的重要课题，其基本特征是DNA序列的永久性改变，包括点突变、缺失、倒位和易位等类型。其中，点突变的检测因其与多种疾病密切相关，如镰状细胞贫血和β-地中海贫血，一直是科研领域的重点研究方向。然而，点突变通常在样本中丰度较低，给检测技术带来了显著挑战。传统的检测方法如Sanger测序虽然在早期发挥了重要作用，但其过程繁琐且成本高昂，难以满足大规模检测的需求。随着下一代测序（NGS）和第三代测序（TGS）的发展，虽然这些技术在通量和灵敏度方面有所提升，但仍存在读长短、依赖PCR、成本高以及错误率较高等问题。因此，研究者们不断探索基于核酸探针的新技术，以提高点突变检测的效率和准确性。本文将对这些技术进行系统总结，并探讨其优缺点以及未来发展方向。

### 1. 酶辅助的点突变检测技术

酶在基因突变检测中扮演着关键角色，它们具有高度的特异性与选择性，能够识别特定的碱基配对状态。基于酶的检测方法通常不需要复杂的仪器，适用于高通量和现场检测。然而，这些方法在检测稀有突变时仍存在一定的局限性，例如对特定序列的高度依赖性以及在复杂样本中可能表现出的较低灵敏度。为了解决这些问题，近年来的酶工程化发展为酶辅助检测提供了新的思路。例如，基于CRISPR-Cas系统的引导酶能够精准识别目标序列，实现对突变的高效检测。然而，该系统也面临一些问题，如对PAM序列的依赖性，以及潜在的脱靶效应，这限制了其在实际应用中的广泛使用。此外，为了提升灵敏度，研究者尝试将酶与信号读取技术相结合，如荧光信号和电化学信号，以增强检测的准确性和可重复性。

在基于酶的检测中，Ago蛋白因其在RNA干扰中的重要作用而备受关注。Ago蛋白能够识别特定的RNA分子，并在指导下对目标DNA或RNA进行切割。例如，PfAgo蛋白被用于构建PAND（PfAgo-mediated Nucleic Acid Detection）系统，该系统利用PfAgo的高特异性识别能力，结合荧光探针实现对SNP的检测。这种技术不仅提高了检测灵敏度，还能够同时检测多个突变位点。在临床应用中，PAND技术成功检测了BRCA1、KRAS G12D和EGFR T790M等突变，其背景噪声低至0.1%。然而，该方法仍面临一些挑战，如Ago蛋白的运输效率、免疫反应以及如何进一步提升其特异性。

DNA酶（DNAzymes）作为替代传统酶的新型工具，也在点突变检测中展现出广阔的应用前景。DNAzymes是通过体外筛选（SELEX）获得的单链DNA分子，相较于传统蛋白酶，它们在耐受性和稳定性方面表现更优。DNAzymes在检测点突变时，能够通过特定设计实现对单碱基错配的高度识别。例如，利用G-四链体DNAzyme的过氧化物酶样活性，可以将突变DNA的信号转化为可测的荧光或比色信号。然而，DNAzymes的催化活性仍需进一步提升，特别是在复杂生物样本的离子环境中，其活性可能会受到限制。此外，如何在实际应用中放大DNAzyme信号，仍是当前研究的热点。

### 2. 纳米材料辅助的点突变检测

纳米材料因其独特的物理化学性质，如光学行为、表面可修饰性和优异的电化学特性，被广泛应用于点突变检测技术中。其中，金纳米颗粒（AuNPs）因其良好的生物相容性、表面修饰能力和稳定性，成为构建纳米材料检测系统的重要选择。AuNPs可以与目标DNA发生特异性结合，从而通过颜色变化或电化学信号的变化实现突变检测。例如，通过设计互补的探针序列，AuNPs能够区分完全匹配的DNA和单碱基错配的DNA，从而实现对突变的识别。在某些研究中，AuNPs被用于构建多重检测系统，能够在同一反应中检测多个突变位点，如EGFR基因的L858R突变。然而，这些方法仍面临一些挑战，如高GC含量序列或复杂二级结构对信号的干扰，以及如何在不同实验条件下实现信号的稳定性和可重复性。

另一种重要的纳米材料是石墨烯氧化物（GO），其独特的二维结构和丰富的表面官能团使其在电化学检测中具有显著优势。GO能够有效淬灭电化学发光（ECL）信号，同时在目标DNA存在时恢复信号，从而实现对突变的识别。这种技术已经被应用于TP53基因突变的检测，并在多个实验中展现出良好的灵敏度和特异性。然而，GO的使用也存在一定的局限性，如对电极表面的修饰要求较高，以及在实际应用中可能引发的免疫反应和毒性问题。因此，如何进一步优化GO的性能，使其更适用于临床检测，是当前研究的重要方向。

此外，量子点（QDs）因其高荧光量子产率和低背景噪声，也被广泛应用于点突变检测。QDs可以通过荧光信号的变化实现对突变的识别，如利用不同大小的QDs结合特定的探针，从而区分突变DNA和野生型DNA。例如，基于QDs的检测系统能够实现对EGFR T790M突变的检测，其检测灵敏度可达0.01%。然而，QDs的荧光淬灭现象可能影响检测结果的准确性，因此需要进一步优化其信号读取方式，以减少背景干扰并提高信号的稳定性。

表面增强拉曼散射（SERS）技术因其极高的灵敏度和独特的分子指纹特性，成为检测点突变的新兴方法之一。SERS利用纳米材料表面的局部表面等离子体共振（LSPR）和化学增强机制，显著提升了拉曼信号的强度，使得单分子检测成为可能。例如，基于银纳米颗粒（AgNPs）的SERS系统可以实现对KRAS G12V突变的检测，其检测灵敏度可达50 fM。然而，SERS技术仍面临一些挑战，如信号稳定性不足、背景干扰严重以及对实验条件的依赖性较强。因此，未来的研究需要进一步优化SERS信号的读取方式，以提高其在复杂样本中的应用能力。

### 3. 核酸类似物辅助的点突变检测

除了传统酶和纳米材料，核酸类似物（如肽核酸，PNA和锁核酸，LNA）也被广泛应用于点突变检测。PNA因其中性的伪肽骨架和对互补序列的高亲和力，能够在复杂样本中实现更高效的突变识别。例如，通过将PNA探针与CRISPR-Cas12b系统结合，可以实现对SNP的高灵敏度检测，其检测限可达300 pM。然而，PNA的合成成本较高，且其在体内的稳定性仍需进一步优化。此外，PNA探针的结合位点需要精确设计，以确保其在不同样本中的应用效果。

LNA是另一种具有独特结构的核酸类似物，其通过甲基桥连接核糖环的2′-氧和4′-碳原子，使其在互补序列中具有更高的结合亲和力和热稳定性。LNA探针在检测点突变时表现出良好的特异性，能够有效区分野生型和突变型序列。例如，结合LNA探针和金纳米颗粒（AuNPs）的检测系统，可以实现对EGFR突变的高灵敏度检测，其检测限可达0.4 nM。然而，LNA探针的高成本和对特定实验条件的依赖性，限制了其在大规模检测中的应用。因此，未来的研究需要探索更经济的合成方法，以降低LNA的使用成本。

### 4. 纯核酸探针的点突变检测

纯核酸探针检测方法不依赖于外源性成分，而是通过核酸本身的二级结构和动态分子反应实现对单碱基差异的识别。这种方法通常基于核酸的热力学行为，如探针与目标序列的结合和解离过程。例如，Wu等人提出的终端竞争性核酸探针（TSCP）系统，通过设计长链和短链探针，能够在目标序列存在时实现信号的激活，从而检测出突变位点。这种方法的优势在于无需引入其他酶或纳米材料，能够实现快速、高效的突变识别。然而，其在复杂样本中的抗干扰能力较弱，且对特定的热力学参数（如GC含量）较为敏感。因此，未来的研究需要进一步优化探针设计，以提高其在不同样本中的适用性。

此外，一些研究者尝试通过化学修饰（如芘和2′-O-甲基RNA）来增强纯核酸探针的结构稳定性和检测灵敏度。例如，结合催化发夹组装（CHA）、FRET和发夹介导的链置换（TMSD）技术，可以实现对突变的双重识别，其检测限可达4.3 fM。然而，这些方法仍面临一些挑战，如对实验条件的依赖性较强，以及如何在复杂样本中提高检测的准确性。因此，未来的研究需要进一步探索纯核酸探针的优化策略，以提升其在实际应用中的表现。

### 5. 从实验室到临床的挑战与应用前景

尽管上述多种检测技术在实验室研究中表现出良好的性能，但它们在临床应用中仍面临诸多挑战。首先，实验室样本与真实临床样本存在显著差异，如复杂的背景干扰和样本处理条件的不同，可能影响检测的准确性。其次，许多检测方法依赖于特定的探针设计和信号读取技术，这要求在临床应用中进行大规模的验证和优化。例如，基于CRISPR-Cas系统的检测方法虽然具有高灵敏度和特异性，但其对PAM序列的依赖性和潜在的脱靶效应仍需进一步解决。

为了推动这些技术在临床中的应用，研究者们正在探索更简单、高效的检测策略。例如，基于PCR的检测系统（如荧光PCR和数字PCR）因其操作简便和成本较低，已成为临床检测的重要手段。然而，PCR方法仍需依赖复杂的热循环过程，这可能限制其在某些特定场景中的应用。此外，一些研究尝试将核酸探针与电化学检测技术结合，以提高检测的灵敏度和特异性。例如，通过将AuNPs与DNA探针结合，构建电化学传感器，可以实现对突变的高效检测。然而，如何确保这些方法在不同样本中的适用性，以及如何减少其对实验条件的依赖，仍是当前研究的重点。

### 6. 人工智能在核酸探针检测中的应用

近年来，人工智能（AI）技术在基因突变检测中展现出巨大的潜力。AI不仅可以辅助探针设计，还能优化信号分析和检测系统，提高检测的准确性和效率。例如，通过机器学习算法预测探针与目标序列的结合效率，可以减少探针设计的试错过程，提高检测的成功率。此外，AI还能用于处理复杂的信号数据，如荧光信号、电化学信号和SERS信号，以减少人为误差并提高检测的自动化水平。

在信号分析方面，AI技术已经被应用于多种检测系统，如基于RCA和RPA的电化学检测平台。这些系统能够通过机器学习模型实现对突变的自动化识别，从而减少人工干预。例如，Sebuyoya等人的研究显示，AI模型可以实现对KRAS G12V突变的高灵敏度检测，其检测限为1%。此外，AI还能用于优化检测流程，如基于深度学习的ddPCR数据分类系统，能够显著提高分类的准确性，减少人为因素的影响。

尽管AI在基因突变检测中展现出诸多优势，但其在实验室与临床之间的整合仍面临一定挑战。首先，AI模型的训练需要大量高质量的样本数据，而不同实验室之间的仪器和环境差异可能导致数据不一致。其次，许多复杂的AI模型缺乏可解释性，这限制了其在临床实践中的应用。此外，AI技术的临床应用需要经过严格的临床试验和监管审批，这可能是一个耗时且成本高昂的过程。因此，未来的研究需要进一步探索AI在基因突变检测中的适用性，以确保其在实际应用中的可靠性和可重复性。

### 7. 未来展望

基因突变的检测技术正不断向更高灵敏度、更强特异性和更简便的操作方向发展。随着第三代测序技术的成熟，越来越多的检测策略将被开发，以适应TGS的需求。同时，AI技术的快速发展也为突变检测提供了新的思路，如探针设计优化、信号分析和检测系统自动化。此外，基于大数据和深度学习的检测模型将有助于解决当前检测技术中的某些难题，如生物反应的不确定性、信号的复杂性等。

未来，研究者们需要在多个方面进行探索和优化，以推动基因突变检测技术的进一步发展。这包括探针设计的优化、检测系统的简化、信号读取技术的提升以及AI技术的深入整合。同时，检测技术的临床应用也需要进一步验证，以确保其在不同人群中的适用性。随着这些技术的不断进步，我们有望看到更加高效、准确和经济的基因突变检测方法，为疾病诊断和精准医学提供强有力的支持。