基于辅因子依赖性酶连接触发滚环扩增辅助CRISPR–Cas12a策略的便携式ATP检测及其在肉类新鲜度评估中的应用

本综述创新性地提出了一种将辅因子依赖性酶连接触发的滚环扩增（RCA）与CRISPR–Cas12a系统相结合的新型生物传感策略，通过个人血糖仪（Glucometer）实现三磷酸腺苷（ATP）的便携式超灵敏检测（检测限达1.08 nmol/L）。该方法利用T4 DNA连接酶对ATP的特异性依赖启动RCA反应，进而激活Cas12a的反式切割活性，最终通过蔗糖-葡萄糖信号转化系统输出可定量电信号。该技术为肉类食品新鲜度评估和微生物污染监测提供了强有力的现场检测工具。

　　

亮点

材料与试剂

三磷酸腺苷（ATP）、鸟苷一磷酸二钠盐（GMP）和转化酶（Invertase）购自Sigma Aldrich公司（美国圣路易斯）。EnGen Lba Cas12a（Cpf1, 100 μM）、NEBuffer（r1.1, r2.1, r3.1, rCutSmart）和Hi-T4 DNA连接酶（400 U/μL）购自英国纽英伦生物科技有限公司（Ipswich）。Millex-GP（0.22 μm亲水性PES膜过滤单元）和Amicon-3K/100K离心过滤器购自Millipore公司（美国Billerica）。羧基修饰磁珠（SA-MB）……

I-M探针表征

I-M探针由两部分组成：ssDNA-转化酶复合物和链霉亲和素磁珠（SA-MB）。借助异双功能连接剂磺基-SMCC成功实现了转化酶与ssDNA的共价连接（图2A）。由于DNA具有更高的摩尔消光系数（ε），ssDNA-转化酶复合物在260 nm处（ssDNA组分的吸收峰）的吸光度显著高于280 nm处（转化酶组分的吸收峰），且与单纯ssDNA相比出现明显红移（图2B）。

结论

综上所述，我们成功验证了辅因子依赖性酶连接触发RCA辅助CRISPR–Cas12a策略结合血糖仪可用于肉类表面ATP的定量检测。该方法凭借T4 DNA连接酶对ATP的特异性识别以及RCA与CRISPR–Cas12a的双重信号放大作用，展现出卓越的特异性和灵敏度（检测限低至1.08 nmol/L）。此外，通过荧光恢复实验和商品化ATP检测试剂盒的对比验证，进一步证明了该策略的可靠性。