综述：细胞外囊泡：抗病毒功能及其在治疗和疫苗中的应用

本综述系统阐述了细胞外囊泡（EVs）在病毒感染中的双重角色：既作为病毒传播的“特洛伊木马”，又是宿主抗病毒免疫的关键介质。文章重点介绍了EVs作为天然纳米载体，通过工程化改造（如表面修饰和药物装载）在靶向递送抗病毒分子（如CRISPR/Cas9系统、IFITM3蛋白）和疫苗开发（如基于EV的mRNA疫苗）中的前沿应用，为应对HIV、SARS-CoV-2、肝炎病毒等提供了新策略。

　　

细胞外囊泡：抗病毒功能及其在治疗和疫苗中的应用

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由几乎所有细胞类型分泌的纳米级膜性囊泡，在病毒感染过程中扮演着复杂的双重角色。它们一方面通过包装完整的传染性病毒颗粒或功能性病毒基因组来促进感染传播，另一方面又通过递送免疫活性物质参与宿主抗病毒免疫应答。此外，EVs本身也能发挥直接抗病毒作用，例如通过与病毒颗粒竞争结合宿主细胞受体（如磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）受体）来阻断病毒入侵。

EVs的生物发生与异质性

EVs是由脂质双层膜包裹的异质性颗粒集合体，根据其物理尺寸和生物发生途径主要分为两大类：直径超过200 nm的大EVs通常通过质膜脱落或出芽产生；而小EVs（包括经典的外泌体）直径一般小于200 nm，主要经由内体途径形成，其特征是内体向内出芽形成多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs），随后与质膜融合释放到细胞外。鉴于目前精确区分囊泡生物发生机制的技术挑战，国际细胞外囊泡学会（ISEV）不再推荐使用基于分泌途径的传统分类术语（如外泌体、微囊泡等）。

EVs的生物发生是一个精密的过程，涉及多种生物分子选择性装载的机制。这些机制包括ESCRT（内体分选复合物） machinery、外泌体LAMP2A货物装载（e-LLoC）机制、caveolin依赖的RNA输出以及ceramide依赖的microRNA（miRNA）分选等。此外，微囊泡货物的选择性还受到诸如v-SNARE蛋白、脂筏微结构域和细胞骨架蛋白等多种因素的影响。

EVs固有的异质性是其临床转化面临的主要挑战之一。这种异质性不仅体现在物理性质（如尺寸、密度）的差异上，更体现在分子组成（如膜蛋白的非均匀分布）上。与理化性质严格受控的合成纳米载体不同，EVs作为递送载体本身的异质性常被忽视。应对这一挑战需要三大支柱策略：实施互补的单囊泡分析技术、建立标准化的功能测定方法以及利用人工纳米囊泡（ANVs）作为基准或替代品。

激活先天免疫反应

在病毒感染过程中，EVs能够作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活宿主的模式识别受体（PRRs），从而启动先天免疫应答。例如，在登革病毒（DENV）感染中，携带病毒NS3蛋白的巨噬细胞来源EVs可诱导内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和IL-10等细胞因子，同时上调细胞间粘附分子（ICAM）和VE-钙粘蛋白等粘附分子的表达，从而启动早期宿主防御机制。

EVs还通过转移抗病毒效应分子来调节先天免疫反应。研究表明，受感染源细胞释放的EVs可通过递送干扰素（IFN）信号通路中间产物或干扰素刺激基因（ISGs）产物来抑制病毒在邻近细胞中的复制和传播。在HIV-1感染中，宿主细胞胞质病毒核酸识别机制合成的cGAMP可被装载入EVs，并与病毒颗粒共同递送至靶细胞，从而激活STING依赖的IFN基因通路发挥抗病毒作用。

非编码RNA也是EVs介导先天免疫的重要武器。在甲型流感病毒（IAV）感染中，宿主细胞将病毒RNA片段加工成功能性小RNA片段（如hsa-miR-1975），并通过EVs运输到未感染细胞，有效启动I型IFN介导的抗病毒防御系统。

激活适应性免疫反应

EVs构成了连接先天免疫和适应性免疫的关键桥梁。一方面，它们诱导受体细胞分泌促炎细胞因子，从而激活适应性免疫反应并招募免疫细胞。在呼吸道合胞病毒感染中，EVs递送病毒成分刺激单核细胞和气道上皮细胞产生MCP-1/IP-10/CCL5和CCL5/IP-10/TNF-α等趋化因子来抵抗感染。

抗原呈递是EVs参与抗病毒免疫调节的核心机制之一。抗原呈递细胞（APCs）（如树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和B细胞）释放的EVs表达主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类-抗原复合物，可直接分别激活CD8⁺或CD4⁺ T细胞。这些EVs还通过将MHC-抗原复合物转移至其他APCs来间接刺激免疫反应。

值得注意的是，EVs介导免疫增强的另一个关键因素在于其表面分子（如四跨膜蛋白CD9/CD63/CD81和整合素CD11b），这些分子使其能够与免疫细胞相互作用。在EBV相关肿瘤疾病中，活化的Vδ2-T细胞分泌的EVs不仅富含Fas配体、TRAIL和NKG2D等效应分子（诱导受体细胞死亡或激活自然杀伤（NK）细胞），还携带共刺激配体CD80/CD86和MHC I/II类复合物。这些分子整合到受体细胞膜中，显著增强了EBV感染肿瘤细胞对肿瘤和病毒抗原的抗原呈递效率，从而有效激活CD4⁺ T细胞介导的辅助免疫应答和CD8⁺ T细胞特异性细胞毒功能。

直接抗病毒作用

除了调节免疫反应外，EVs作为生物活性分子的天然载体，可直接运输具有抗病毒功能的组分。例如在DENV感染期间，受感染细胞释放含有IFN诱导跨膜蛋白（IFITM）的EVs。IFITM作为一种先天效应蛋白，通过阻断病毒包膜与宿主内溶酶体区室之间的膜融合来抑制病毒进入。类似地，IAV感染细胞分泌的EVs也富含IFITM蛋白，这些蛋白不仅通过限制病毒融合和进入来提供抗病毒保护，还通过刺激未感染细胞分泌IL-6、TNF-α和MCP-1等促炎细胞因子来增强免疫反应。

从HIV感染细胞中分离的EVs被证明携带抗病毒蛋白APOBEC3G，这是一种胞苷脱氨酶，在整合到病毒颗粒后，在逆转录过程中诱导病毒RNA发生G-to-A超突变，从而抑制病毒复制。此外，灵长类动物特有的C19MC miRNA簇在妊娠期间仅在胎盘表达，通过滋养层EVs转移其编码的miRNAs，通过非IFN依赖途径抑制病毒活性，建立了一种独特的先天抗病毒防御机制。

EVs还能通过受体竞争发挥抗病毒作用。在流感病毒感染中，表面装饰有α-2,3和α-2,6唾液酸的EVs通过在与靶细胞相互作用前结合流感病毒颗粒，竞争性阻断病毒进入。在HIV感染中，T淋巴细胞分泌的CD4⁺ EVs通过其表面CD4分子与HIV包膜糖蛋白gp120高亲和力结合，通过占据病毒入侵靶细胞所需的结合位点，阻断病毒与宿主细胞CD4受体的结合。

最近研究揭示了一个新兴概念——病毒凋亡拟态（viral apoptotic mimicry），这是许多包膜病毒（和一些非包膜病毒）采用的关键策略，以促进感染和免疫逃避。其核心机制涉及利用宿主清除凋亡细胞的保守途径：在凋亡过程中，细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸（PS）。这种“eat-me”信号被广泛表达的PS受体识别，如TIM家族和TYRO3、AXL和MERTK（TAM）受体家族（Tyro-3、Axl和Mer）的受体。这些受体的结合触发凋亡细胞的吞噬清除，这一过程与免疫抑制信号相关。

来自各种生理体液（如精液、唾液和尿液）的EVs在高生理浓度下表现出强效抗病毒活性。这些液体来源EVs的一个关键共同特征是表面富含高水平的PS。它们通过凋亡拟态机制作为竞争性抑制剂：体液性EVs表面暴露的PS抢先占据宿主细胞PS受体（如Axl和TIM-1）。这种占据有效阻断了依赖相同受体途径进入细胞的病毒的附着和内化，包括寨卡病毒（ZIKV）、DENV、西尼罗河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）和EBOV。例如，精液来源的EVs抑制ZIKV感染的半数最大抑制浓度（IC₅₀）为6.02×10¹⁰颗粒/mL。关键的是，这种抗病毒效力与PS暴露水平呈直接正相关。支持这一因果关系的是，通过酶消化去除EV表面的PS会消除抗病毒活性，而恢复PS则能恢复活性。这一机制解释了为什么缺乏暴露PS的EVs的体液环境（如仅含约0.1 mol% PS的血液EVs）显示出显著减弱的抗病毒能力。进一步地，它阐明了为什么依赖凋亡拟态进入的病毒（如ZIKV和DENV等黄病毒）主要利用缺乏富含PS的EVs的传播途径（如蚊虫叮咬），而不是通过富含暴露PS的EVs的体液直接人际接触。

EVs作为治疗和药物递送剂

自20世纪90年代以来，合成纳米颗粒（如脂质体、胶束、树枝状聚合物、聚合物和无机纳米颗粒）已成为临床药物递送的关键工具，通过增强药物的时空分布谱来提高治疗效果并降低毒性。然而，其临床应用受到稳定性差、脂质氧化、药物提前释放以及外源成分引起的生物相容性问题等限制，这些问题可能诱发过敏反应和免疫原性风险。

相比之下，EVs拥有天然的脂质双层膜结构，能够有效封装核酸和蛋白质等生物分子，同时抵抗酶降解。此外，EVs与宿主细胞具有高度同源性，使其能够逃避免疫清除并穿越生理屏障（如血脑屏障和胎盘屏障）进行靶向递送。这些生物学特性赋予EVs相比传统合成载体更优越的安全性、靶向效率和药物保护特性，凸显了其增强的临床潜力。

目前EV药物装载方法主要涉及被动和主动两种途径。被动装载（如共孵育）依靠浓度梯度促进分子自发跨EV膜扩散。虽然操作简单，但该方法装载效率低，分子选择性有限。相比之下，主动装载采用电穿孔、超声或化学透化等技术破坏膜完整性，增强药物掺入。虽然这增加了药物有效载荷，但物理化学应力可能损害EV膜完整性，从而影响其固有的递送能力。

HIV中的应用

工程化EVs凭借其精确的靶向能力和低免疫原性，已成为递送抗病毒治疗剂的关键平台，在克服HIV治疗关键瓶颈方面展现出重大前景。为激活潜伏的HIV-1储存库，研究人员实现了将不稳定的病毒转录激活剂Tat蛋白定向封装到EV腔内，同时在囊泡表面展示源自IL-16的CD4靶向结构域。这种工程策略实现了对CD4⁺ T细胞的特异性递送。由此产生的工程化EVs有效刺激了潜伏感染前病毒的转录，诱导其进入可被抗逆转录病毒药物清除的再激活状态，同时避免了显著的异常免疫反应。

专注于增强靶向细胞清除的补充策略涉及在EV表面装饰高亲和力HIV-1特异性抗体（如源自10E8单克隆抗体的单链可变片段（scFv）），并在囊泡腔内同时包装治疗性载荷（如姜黄素或促凋亡miRNA-143）。这种方法创建了一个双功能递送系统，既能精确识别受感染细胞，又能诱导细胞凋亡。实验证据证实，这些抗体靶向的药物装载EVs特异性识别并杀死表达HIV包膜蛋白的细胞（包括脑内储存库部位），其功效已在动物模型中得到验证。

此外，还开发了利用EVs递送基因编辑或表观遗传调控工具以实现持久病毒抑制的策略。例如，通过EVs递送的锌指蛋白ZFP-362可特异性结合HIV-1启动子序列。通过招募DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）的催化结构域，它在启动子区域诱导稳定、长期的甲基化修饰，从而有效表观遗传沉默整合的前病毒。这种外泌体递送的ZFP-362在人性化NSG小鼠模型中有效抑制了多个组织（包括骨髓、脾脏和大脑）中的HIV复制。总之，这些研究证明了工程化EVs在靶向递送多种效应分子以实现HIV储存库激活、清除受感染细胞或长期抑制方面的强大能力和多样化应用潜力。

SARS-CoV-2中的应用

EVs，特别是间充质干细胞来源的EVs（MSC-EVs），在对抗COVID-19的治疗策略中展现出巨大潜力。MSCs的治疗机制涉及调节免疫细胞的效应功能。已发表的研究表明，MSCs抑制肺部浸润并缓解肺水肿。这些细胞具有多能性、再生能力和自我更新能力，使其能够抑制免疫反应并在体外分化为II型肺泡上皮细胞。

在一项评估急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的II期临床试验（NCT03608592）中，MSCs表现出显著的抗炎活性。安全性试验结果表明，MSCs可改善SARS-CoV-2相关的细胞因子风暴（CS）和ARDS，可能为慢性呼吸功能障碍和肺纤维化提供一种前瞻性治疗方法。

此外，在一项独立研究（NCT04276987）中，通过吸入给COVID-19患者施用MSC-EVs被证明安全且耐受性良好，未报告预定的不良事件。该疗法显著改善了淋巴细胞计数，降低了包括IL-6在内的炎症标志物，并促进了肺修复，同时减轻了危重COVID-19患者的纤维化。

一项最近的前瞻性非随机开放标签队列研究评估了同种异体骨髓MSC来源的EVs（BM-MSC-EVs）在24名患有中度至重度ARDS的SARS-CoV-2感染受试者中的疗效。结果证实了优异的安全性（无治疗相关不良事件），同时显著改善了氧饱和度。这种改善与绝对中性粒细胞计数减少、淋巴细胞计数增加以及急性期反应物（如C反应蛋白、铁蛋白和D-二聚体）水平降低相关。

此外，源自特定免疫细胞类型或经过工程化改造以携带抗病毒成分的EVs显示出对抗COVID-19的直接治疗潜力。例如，一项正在进行的临床试验（NCT04389385）提议使用源自SARS-CoV-2特异性片段肽激活的T细胞的EVs来治疗早期COVID-19。这些EVs可能含有有效的介质，如干扰素-γ（IFN-γ），可能通过直接与病毒相互作用或保护易感细胞免受病毒识别来有效拮抗SARS-CoV-2感染。

由于重组可溶性血管紧张素转换酶2（rsACE2）蛋白可以竞争性抑制SARS-CoV-2与ACE2表达细胞的结合，研究人员开发了含有ACE2的EVs，通过与病毒刺突（S）蛋白结合来捕获SARS-CoV-2，表明工程化EVs是阻断SARS-CoV-2感染的一种有前景的策略。进一步的证据表明，用S蛋白装饰的MSC-EVs占据II型肺泡上皮细胞上的ACE2受体。这种竞争性结合有效阻断了SARS-CoV-2的细胞摄取并保护细胞免受病毒感染。通过严谨全面的研究，工程化EVs有望在对抗COVID-19和其他传染病中发挥重要作用。

肝炎病毒中的应用

基因编辑技术与EVs的整合进一步拓宽了抗病毒治疗的前沿。例如，CRISPR/Cas9系统的关键组件——包括以其基因组编辑精度而闻名的向导RNA（gRNA）和Cas9蛋白——已被成功包装到EVs中并实现功能性递送。研究证实，内源性来源的EVs可以成功递送功能性Cas9蛋白与HBV特异性gRNA配对，促进肝细胞模型（如Huh7细胞）中HBV DNA的高效切割。这证明了应用EV介导的递送进行针对病毒性疾病基因治疗的可行性。

同时，源自不同细胞类型的EVs展现出独特的治疗价值。源自特定肿瘤细胞或用此类EVs脉冲处理的DCs的EVs可以通过直接或间接的免疫调节机制（如减少肿瘤微环境中调节性T细胞（Tregs）的积累）诱导有效的抗肿瘤免疫力并重塑肿瘤免疫微环境。相反，脐带间充质干细胞（uMSC-EVs）分泌的EVs已被证明能在体外有效抑制HCV感染和复制，且细胞毒性低。此外，富含肿瘤相关抗原（TAAs）的树突状细胞来源的EVs显示出作为创新性无细胞免疫治疗疫苗的前景。例如，在肝细胞癌（HCC）模型中，富含甲胎蛋白（AFP）的树突状细胞来源的EVs引发了强大的抗原特异性免疫反应，从而延迟了肿瘤进展并显著延长了生存期。

其他病毒中的应用

在ZIKV感染中——一种已知会导致胎儿神经发育缺陷的病原体——缺乏有效的预防性疫苗，加上需要穿越胎盘屏障并满足胎儿治疗的严格安全要求，给治疗此类疾病带来了重大的全球公共卫生挑战。为此，研究人员创新性地开发了装载IFITM3的工程化EVs，IFITM3是一种定位于内体-溶酶体膜的内在抗病毒蛋白，通过阻断病毒包膜与宿主细胞之间的膜融合来抑制病毒复制，并在胎盘中高表达。动物研究证实，这些工程化EVs不仅完全保留了IFITM3的生物活性，而且由于天然趋向性实现了向胎盘组织的靶向递送，显著降低了胎儿病毒感染率。

在HSV-1的治疗中，最近的研究创新性地利用了人免疫球蛋白G（IgG） Fc片段与金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）之间的高亲和力相互作用。具体而言，将人Fc结构域锚定到EV跨膜支架蛋白前列腺素F2受体负调节因子（PTGFRN-△687）上，同时将SpA结构域融合到Cas9蛋白上。这种工程策略显著提高了Cas9核糖核蛋白（RNPs）在EVs内的富集效率（提高了近2倍）。随后用狂犬病病毒糖蛋白衍生的RVG29肽进行表面修饰，赋予EVs靶向神经趋向的递送能力，使其能够精确递送到HSV-1潜伏的神经组织，如三叉神经节。同时，共掺入的水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）介导了有效的内体/溶酶体逃逸，促进了Cas9/sgUL29复合物的释放，该复合物特异性切割 essential 病毒基因UL29。在小鼠模型中的实验验证表明，通过这种多方面的