基于CRISPR-Cas9的智能基因回路精准调控前列腺癌细胞行为的创新研究

本研究针对前列腺癌(PCa)传统疗法在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)阶段失效的临床难题，创新性地构建了可自动识别肿瘤微环境的智能AND门基因回路(PCa-GC)。通过合成前列腺组织特异性启动子S(prostate)p和肿瘤特异性启动子S(cancer)p，结合CRISPR-dCas9系统实现对P21、E-cadherin和Bax等靶基因的精准调控，在体外和体内实验中均显著抑制前列腺癌细胞恶性表型，为前列腺癌的精准诊疗提供了新型技术平台。

　　

前列腺癌作为男性最常见的恶性肿瘤之一，在西方世界位居男性癌症相关死亡原因的第二位。虽然雄激素剥夺疗法(ADT)作为一线治疗方案在初期能有效缓解病情，但一旦肿瘤进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)，传统疗法便逐渐失效。尽管新兴研究揭示了CRPC的某些机制并发现了新的治疗靶点，但患者的替代治疗方案仍然有限，预后较差。这种临床困境迫切要求开发能够识别各阶段前列腺癌的新技术，从而改善前列腺癌的诊断和治疗效果。

在此背景下，基因回路技术为精准癌症治疗提供了新的思路。智能合成基因回路具有高特异性、动态可调控性和模块化可编程性等核心优势，通过合理的纳米材料、细菌或其他递送策略，这些回路能够在疾病部位自主激活，准确识别和消除肿瘤细胞，同时最大限度地减少对健康组织的脱靶毒性。然而，构建能够自动感知细胞内特定环境特征的逻辑回路常常面临困难且缺乏敏感性，这成为该领域发展的关键瓶颈。

针对这一挑战，研究人员开展了一项创新性研究，成果发表在《Technovation》上。该研究通过从头合成能够感知细胞的特异性启动子，并利用不同类型启动子的组合，构建了能够灵敏调节特定细胞类型中基因表达的智能基因回路。

研究采用的主要技术方法包括：启动子设计与质粒构建技术，通过合成前列腺特异性抗原(PSA)启动子和前列腺特异性膜抗原(PSMA)增强子元件，构建组织特异性启动子；CRISPR-dCas9基因编辑系统，建立分裂式表达体系；体外细胞功能实验（包括CCK-8增殖检测、EdU掺入实验、伤口愈合实验和细胞凋亡检测）；以及体内裸鼠皮下异种移植瘤模型验证。使用的细胞系包括正常前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌细胞系DU145和PC3，以及其他对照细胞系。

研究结果方面：

合成启动子的设计与构建

研究人员通过改造hTERT启动子构建了肿瘤特异性启动子S(cancer)p，该启动子在所有测试的肿瘤细胞系中表现出强大的转录活性，而在正常对照细胞中活性非常低。同时，利用PSA启动子的AREc区域和PSMA增强子转录因子结合区域，分别构建了S(PSA)p和S(PSMA)p启动子，最终开发出合成前列腺识别启动子S(prostate)p，该构建体表现出更强大的转录活性和优异的前列腺组织特异性。

前列腺肿瘤特异性识别基因回路的构建与优化

研究团队构建了人工AND门基因回路(PCa-GC)，采用模块化CRISPR/dCas9系统，由分离的dCas9蛋白和sgRNA组件组成。通过优化sgRNA与dCas9-VP64的表达比例，发现当S(prostate)p驱动4个串联sgRNA与S(cancer)p驱动的dCas9表达相结合时，基因回路效率最高。该回路仅在测试的前列腺癌细胞系中表现出强大的活性，而在其他细胞系中活性较弱。

特异性抑制前列腺癌细胞体内恶性表型

研究发现，该基因回路能够选择性增加P21蛋白表达在前列腺癌细胞中，显著抑制细胞活力并减少S期细胞比例。当将输出改为E-cadherin基因时，该回路特别提高了前列腺癌细胞中的E-cadherin水平，导致迁移减少。此外，通过调节Bax基因表达，该回路能选择性诱导前列腺癌细胞凋亡。

体内特异性识别和抑制前列腺癌

在体内实验中，全身荧光成像系统显示，前列腺癌肿瘤组织中的荧光信号明显高于其他癌细胞系产生的组织。皮下异种移植模型证明，该基因回路对宫颈癌或膀胱癌细胞没有抑制作用，但显著抑制两种前列腺癌细胞系的肿瘤生长。

研究结论与讨论部分指出，该研究创新性地通过结合不同启动子特性，构建了具有前列腺组织识别和肿瘤组织识别特性的新型启动子，并首次使用基于CRISPR-Cas9的"AND门"逻辑设计构建了模块化启动子基因回路，用于特异性检测和治疗各阶段的前列腺癌。

该基因回路的设计考虑了前列腺组织和肿瘤组织的特性，使得基于基因回路的前列腺癌特异性识别和治疗有望实现对各种类型前列腺癌的诊断和治疗。特别是对于晚期难治性前列腺癌患者，当没有治疗方法可用且化疗耐药和转移常见时，这种方法可能代表延长患者生存期的可行手段。而且，这些或类似的基因回路有潜力治疗疾病进展的任何临床阶段的前列腺癌。

更重要的是，该研究中基因回路的所有元件都可以通过AAVs(腺相关病毒)递送用于前列腺癌的注射治疗，这可能是治疗前列腺癌的新策略。这种通过任意操纵肿瘤细胞内的信号传导来治疗任何形式前列腺癌的方式，展现了巨大的临床转化潜力。

该研究不仅为前列腺癌的精准治疗提供了新技术平台，也为其他恶性肿瘤的特异性靶向和重编程提供了框架，代表了基因回路技术在癌症治疗领域的重要进展，具有广阔的临床应用前景。