基于CRISPR/Cas9的豌豆原生质体高效分离与转染体系优化及其在基因组编辑中的应用研究

本研究针对豌豆遗传转化效率低、再生困难等问题，开发了一套高效的原生质体分离与PEG介导的转染体系。通过正交实验优化酶解条件，获得高产高活性原生质体（3.45×107个/克鲜重），并利用GFP报告基因验证转染效率达59%。进一步设计多重gRNAs靶向PsPDS基因，通过体外切割实验和原生质体转染证实高达97%的编辑效率，为豌豆功能基因组研究和无转基因基因组编辑育种提供了高效技术平台。

　　

豌豆（Pisum sativum L.）作为重要的蛋白质来源和固氮作物，在全球粮食安全中扮演着关键角色。然而，其生产正面临气候变化、生物与非生物胁迫的多重挑战，加之植物蛋白需求日益增长，亟需通过遗传改良提升豌豆性状。虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术为作物精准改良带来了革命性突破，但豌豆遗传转化效率低、再生困难等问题严重制约了该技术的应用。传统农杆菌介导的稳定转化方法耗时漫长且效率低下，使得编辑元件的快速验证成为瓶颈。因此，建立高效的原生质体瞬时转化系统，实现编辑元件在体细胞水平的快速验证，对推动豌豆基因编辑育种具有重要意义。

研究人员通过正交实验设计（L₁₆(4⁵)）系统优化了原生质体分离条件，重点考察了纤维素酶（Cellulase R-10）、离析酶（Macerozyme R-10）、甘露醇浓度和酶解时间四个关键因素。使用2周龄幼苗叶片为材料，通过荧光二乙酸酯（FDA）染色评估原生质体活性，并采用PEG介导的转染方法将携带GFP报告基因和CRISPR/Cas9编辑元件的载体导入原生质体。针对豌豆八氢番茄红素脱饱和酶（PsPDS）基因设计两个gRNA，通过体外切割实验验证编辑效率，并利用Inference of CRISPR Edits（ICE）软件分析转染后的编辑效果。

高效豌豆原生质体分离体系的建立

通过正交实验发现，离析酶浓度对原生质体产量影响最大（R=1.90），其次为酶解时间（R=1.23）和甘露醇浓度（R=1.09）。最优条件为：2.5%纤维素酶+0.6%离析酶+0.3M甘露醇+6小时酶解，此时产量达3.45×10⁷个/克鲜重，活性超过90%。

GFP转染验证体系优化

研究表明20% PEG4000、20μg质粒DNA和15分钟转染时间可获得最高转染效率（59±2.64%）。延长或缩短转染时间均会导致效率下降，表明时间窗口对维持原生质体活性至关重要。

PsPDS基因编辑效率验证

针对PsPDS基因第一外显子设计两个gRNA（gRNA1:234bp, gRNA2:315bp），体外切割实验证实两者均能有效切割目标序列。转

转染实验显示，多重gRNA构建体可产生108-109bp的大片段缺失，ICE分析表明最高编辑效率达97%，其中gRNA1编辑效率为18-21%，gRNA2高达49%。

本研究成功建立了豌豆原生质体高效分离与转染技术体系，首次实现了CRISPR/Cas9在豌豆原生质体中的高效编辑。通过正交实验优化显著提高了原生质体产量和活性，利用多重gRNA策略实现了高达97%的编辑效率，突破了豌豆遗传转化效率低的瓶颈。该体系为豌豆基因功能研究提供了高效平台，特别是通过原生质体瞬时表达系统可快速验证编辑元件效果，避免传统稳定转化的漫长周期。研究采用的ICE分析方法有效解决了混合群体编辑效率计算的难题，为单细胞水平编辑评估提供了可靠方案。这些技术突破为豌豆及其他难转化豆科作物的基因编辑育种奠定了坚实基础，对加速作物遗传改良进程具有重要意义。

该研究成果发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》，由印度农业食品生物制造研究所（BRIC-NABI）与波兰植物遗传研究所（IPG PAS）合作完成，Hardeep Singh和Pankaj Kumar为共同第一作者，Siddharth Tiwari和Malgorzata Jedryczka为通讯作者。研究得到印度科技部（DST）与波兰国家学术交流署（NAWA）联合项目的资助。