基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a技术的罗湖病毒快速可视化检测新方法开发及其在水产养殖安全中的应用

本文创新性地将逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与CRISPR/Cas12a系统结合，建立了一种快速、高灵敏、高特异性的蒂拉湖病毒（TiLV）现场检测方法。该方法检测限低至9.10拷贝/反应，与标准荧光法符合率达100%，无需复杂仪器，为水产养殖病原体防控提供了突破性技术支撑。

　　

Main reagents and instruments

RT-RAA核酸扩增试剂盒购自杭州众测公司；病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit, 9766）和细菌基因组提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit, 9763）均购自北京宝日医生物技术有限公司；组织基因组提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit）购自Qiagen公司；EnGen? Lba Cas12a (Cpf1)核酸内切酶、NEBuffer 2.1和RNase Inhibitor均购自美国NEB公司；ssDNA荧光报告分子（5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；crRNA由广州锐博生物科技有限公司合成；重组质粒标准品由铂尚生物技术（上海）有限公司构建；其他化学试剂均为分析纯。主要仪器包括QuantStudio? 5实时荧光定量PCR系统（美国Applied Biosystems公司）、NanoDrop? One超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）、GelDoc? XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）和恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）。

CrRNA screening results

基于CRISPR-Cas12a与RT-RAA的TiLV检测原理示意图见补充材料[图S1]。三种crRNA的筛选结果如图1所示：曲线1、2、3代表crRNA1的扩增效果，曲线4为crRNA1的阴性对照；曲线5、6、7代表crRNA2的扩增效果，曲线8为其阴性对照；曲线9、10、11代表crRNA3的扩增效果，曲线12为其阴性对照。结果表明，crRNA3在浓度为20 nmol/L时表现出最优的扩增效率和信号强度，且阴性对照无背景干扰，因此被选为后续实验的最佳crRNA。

Discussion

自2014年被发现以来，蒂拉湖病毒（TiLV）因其高致死率和对罗非鱼养殖业的巨大经济冲击而引发全球水产领域高度关注（Skornik等, 2021）。目前TiLV的检测方法包括ELISA、PCR和LAMP（Valsalam等, 2023），但这些技术或依赖精密仪器、或易产生交叉污染，难以满足现场快速检测需求。本研究通过整合RT-RAA与CRISPR-Cas12a技术，实现了对TiLV基因组片段3的超灵敏检测（灵敏度达9.10拷贝/反应），且无需复杂设备，大幅降低了操作门槛。该技术不仅克服了传统PCR和RPA的局限性，更为水产病原体的现场监测提供了革命性解决方案。

Conclusion

RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测系统是一种创新的分子诊断技术，它通过逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）高效富集目标RNA，并利用CRISPR-Cas12蛋白对扩增产物的特异性识别与切割实现信号放大。该系统对TiLV的检测灵敏度显著优于现有方法，且具备操作简便、快速（全程＜1小时）、可视化读结果等优势，特别适用于资源有限地区的现场诊断和养殖场疫情监控，对保障水产动物安全流通具有重要实践意义。