酿酒酵母中谷胱甘肽生物合成的系统代谢工程：结合酶筛选的途径平衡实现高产

本刊推荐：为解决传统谷胱甘肽（GSH）提取方法的局限性，研究人员开展了酿酒酵母微生物细胞工厂的系统代谢工程研究。通过宿主筛选、CRISPR/Cas9介导的细菌gshAB整合、启动子调谐及酶融合等策略，成功将摇瓶产量提升至339.3 mg·L?1（4.6倍），并在5-L生物反应器中达到997.46 mg·L?1的高效生产。该研究为工业GSH生物制造提供了从代谢工程到生物工艺的全链条解决方案。

　　

在医药和营养保健品行业中，谷胱甘肽（Glutathione, GSH）作为一种关键的细胞抗氧化剂，具有不可替代的价值。然而，传统的提取方法存在效率低、成本高的问题，限制了其大规模应用。微生物合成被认为是更具潜力的替代方案，其中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其公认的安全 status（GRAS）和良好的工业兼容性，成为理想的生产宿主。但如何在酵母中实现GSH的高效合成，仍面临诸多挑战：内源途径受到反馈抑制、前体供应不足、异源酶表达效率低等问题亟待解决。

针对这些难题，发表在《Engineering Microbiology》上的一项研究通过多层次的代谢工程策略，在酿酒酵母中构建了一个高效的GSH生物合成平台。研究人员首先从多种环境样本中筛选出一株具有优异GSH积累能力的菌株NJ-SQYY，其产量达到74.14 mg·L?1。随后，通过CRISPR/Cas9技术将来自细菌的双功能谷胱甘肽合成酶基因gshAB整合到基因组中，有效绕过了酵母中原有途径的反馈抑制。进一步的优化包括启动子工程、Gsh1-Gsh2酶融合以及关键前体合成基因CYS3的过表达。这些策略的协同作用使摇瓶中的GSH产量提高到339.3 mg·L?1，较原始菌株提升了4.6倍。在5-L生物反应器中进行溶解氧耦合的分批补料发酵后，产量更是达到997.46 mg·L?1，细胞干重中的含量为33.85 mg·g?1，创造了染色体工程酿酒酵母中GSH产量的最高记录。

研究采用了多项关键技术方法：包括CRISPR/Cas9介导的基因组编辑、启动子筛选与优化、酶融合构建、发酵工艺优化（分批补料与溶解氧控制）以及DTNB（5,5′-二硫代双-(2-硝基苯酸)）法测定GSH含量。样本来源包括国内多种酿造环境分离的酵母菌株。

3.1. 菌株分离与表征

通过从酒糟、醋渣和发酵 starter 中分离鉴定31株酵母，发现NJ-SQYY具有最高的GSH产量（74.14 mg·L?1）和细胞含量（8.27 mg·g?1 DCW），因此选为后续代谢工程的底盘菌株。

3.2. CRISPR/Cas9介导的基因组整合gshAB_Ap增强谷胱甘肽生物合成

利用双质粒CRISPR/Cas9系统，将来自胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）的gshAB_Ap基因整合到酵母基因组中。工程菌株SQ1的GSH产量提高至112.74 mg·L?1，细胞含量达11.89 mg·g?1 DCW，证实了异源途径的功能性表达。

3.3. 双功能谷胱甘肽合成酶表达的组合工程提升GSH产量

通过筛选多种细菌来源的gshAB同源基因，发现来自 Streptococcus thermophilus 的gshAB_St效果最优，使工程菌SQ8的产量达到118.65 mg·L?1。启动子优化表明PTDH3（PGAP）驱动表达时效果最好，产量提升至138.52 mg·L?1。但基因剂量增加（多拷贝整合）带来的改善有限，表明细胞资源分配存在上限。

3.4. 系统特异性限制：分子伴侣辅助折叠与YAP1过表达未能增强生产

尽管尝试引入大肠杆菌的GroEL/ES分子伴侣系统以辅助异源GshAB折叠，细胞内GSH含量虽有所提升，但菌体生长受到抑制，总产量未得到改善。同样，过量表达氧化应激响应转录因子YAP1也未显著提升GSH产量，甚至在突变株中引起生长抑制，说明在常规培养条件下Yap1的激活不足或引发代谢负担。

3.5. 通过酶融合和启动子工程协调代谢流优化

构建Gsh1与Gsh2的融合蛋白（GLG），并通过PCCW12启动子表达。在野生型背景中，融合策略使GSH产量提升66.63%，而在已工程化的SQ83菌株中提升幅度较小（12.33%），表明后者可能存在前体或辅因子限制。

3.6. 靶向过表达CYS3通过缓解L-胱硫醚瓶颈增强GSH生物合成

在GSH合成前体途径中，过表达胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3能有效提高GSH产量，使SQ842菌株的产量达到186.45 mg·L?1。其他前体相关基因（如SER3、CYS4、MET16、SHM2）的过表达则未显现明显效果。

3.7. 菌株特异性发酵优化揭示L-半胱氨酸响应的对比模式

在摇瓶发酵中，SQ842菌株在不添加L-半胱氨酸时产量较高（266.22 mg·L?1），而添加外源L-半胱氨酸反而导致产量下降，说明该菌株内源L-半胱氨酸合成已接近细胞耐受上限。相反，亲本菌株SQ84在添加2 g·L?1 L-半胱氨酸时产量达到339.30 mg·L?1。在5-L生物反应器中，SQ84最终产量达997.46 mg·L?1，展示了工业化生产的潜力。

该研究通过系统性的代谢工程策略，成功提升了酿酒酵母中GSH的产量，并深入探讨了异源酶表达、分子伴侣辅助、转录调控及前体供应等多方面因素对代谢途径的影响。其意义不仅在于构建了一个高效的微生物细胞工厂，也为未来相关代谢工程研究提供了重要参考，尤其是在途径平衡、宿主-途径兼容性及发酵工艺优化方面。该成果对工业生物技术领域具有较高的推广价值。