综述：海洋硅藻三角褐指藻作为多功能生物生产底盘的研究进展：当前进展、挑战与展望

本综述系统探讨了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)作为光合细胞工厂的应用潜力。文章详细介绍了该模式硅藻在遗传工具开发（包括CRISPR/Cas基因组编辑）、内源代谢物（如岩藻黄素fucoxanthin和ω-3脂肪酸）工程化改造以及异源生物合成（涵盖萜类、治疗性蛋白和可降解塑料PHB）方面的最新突破，同时分析了规模化生产面临的挑战与未来发展方向。

　　

工具箱创新

三角褐指藻的遗传转化体系自1996年建立以来，已发展出全面的分子工具箱。在转基因元件方面，研究者已鉴定多种组成型启动子（如FCPA、FCPB、谷氨酰胺合成酶GLNA、高丰度分泌蛋白HASP1等）和条件诱导型启动子（氮响应型铵转运蛋白AMT、磷酸盐调节型碱性磷酸酶APase、铁敏感型铁饥饿诱导蛋白等）。化学诱导系统（地高辛和雌二醇调节）实现了基因表达的严格时空控制。亚细胞靶向策略利用质体转运肽、过氧化物酶体靶向信号和HASP1信号肽实现了蛋白的精确定位。

选择标记从传统的抗生素抗性基因（Sh ble、诺尔丝菌素乙酰转移酶NAT）扩展到营养缺陷型标记（尿苷酸合成酶UMPS、腺嘌呤磷酸核糖转移酶APT）。多基因堆叠采用2A肽链连接技术，报告系统涵盖绿色荧光蛋白GFP、mVenus等荧光蛋白以及β-葡萄糖醛酸酶GUS和荧光素酶LUC定量系统。创新的RUBY视觉报告系统通过将酪氨酸转化为甜菜碱素，实现了无需仪器的肉眼检测。

基因组编辑技术经历了从转录激活因子样效应物核酸酶TALENs到CRISPR/Cas9的演进。TALENs技术通过敲除UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP基因使脂质含量提升45倍。CRISPR/Cas9系统通过质粒或核糖核蛋白复合体递送，实现了多基因敲除和同源定向修复HDR介导的精准编辑。双sgRNA载体系统和all-in-one载体ptCC9显著提升了编辑效率，单个sgRNA可靶向保守区域敲除整个基因家族（如FCP蛋白基因）。

转化方法除基因枪法外，电穿孔和细菌接合成为高效替代方案。电穿孔通过增加脉冲频率提升效率，而大肠杆菌介导的接合转化通过oriT转移起源和辅助质粒实现了无需专用设备的基因递送。酵母来源的着丝粒/自主复制/选择标记序列CEN6-ARSH4-HIS3实现了附加体质粒的稳定维持，避免了染色体位置效应，便于合成基因簇的协调表达。

内源代谢物合成工程

岩藻黄素合成工程

岩藻黄素作为三角褐指藻中的高价值类胡萝卜素，其代谢工程策略包括前体增强、转录因子调控和新基因鉴定。通过过表达MEP途径基因（甲基赤藓醇磷酸胞苷酰转移酶CMS、4-胞苷-5-二磷酸-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶CMK、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS）和类胡萝卜素合成基因（八氢番茄红素合酶PSY、番茄红素环化酶LYCB、紫黄质脱环氧化酶类似蛋白VDL）提升了前体供应。紫黄质脱环氧化酶VDE、VDE相关蛋白和玉米黄质环氧化酶ZEP3的共表达使岩藻黄素含量增加4倍以上，为最高报道增幅。质体脂质相关蛋白PAP的过表达通过螯合作用使岩藻黄素积累增加50%。转录调节因子（介质亚基MED8、热激因子HSF3、隐花色素CryP）通过调控类胡萝卜素基因表达精细调节合成过程。热激蛋白HSP1过表达使岩藻黄素和甘油三酯TAG均增加2倍以上。CRISPR/Cas9敲除类胡萝卜素异构酶类似蛋白CRTISO5、VDL和ZEP1揭示了它们在岩藻黄素合成中的功能，推动了代谢网络的更新。

脂肪酸与甘油三酯工程

脂质工程聚焦脂肪酸生产和TAG生物合成。过表达Δ6-和Δ5-脂肪酸去饱和酶基因增加了二十碳五烯酸EPA含量，而球石藻OtElo5 Δ5-延伸酶和Δ6-去饱和酶的共表达实现了二十二碳六烯酸DHA合成。丙二酰辅酶A-酰基载体蛋白转酰酶MCAT和Δ5b去饱和酶共表达提升了长链脂肪酸（花生四烯酸ARA、EPA和DHA）产量。植物酰基-ACP硫酯酶的表达将脂肪酸谱转向月桂酸C12:0和肉豆蔻酸C14:0，适用于生物柴油。内源3-氧酰基酰基载体蛋白还原酶FabG过表达在不影响生长的情况下提高了脂肪酸和脂质产量。Hotdog折叠硫酯酶失活增加了TAG积累并提高了C16:0/C16:1比率。

通过苹果酸酶ME和质体丙酮酸转运体PT过表达将碳流转向TAG合成。脂质合成酶（磷脂二酰甘油酰基转移酶PDAT、甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT、溶血磷脂酸酰基转移酶LPAT、二酰甘油酰基转移酶DGAT）的上调进一步提升了TAG含量。异源脂滴蛋白（来自雨生红球藻和拟南芥）在氮缺乏条件下增强了TAG存储。线粒体β-氧化酶MACAD1和脂酶OmTGL的敲降减少了TAG分解代谢，而竞争途径（1,3-β-葡聚糖合成酶BGS、UGP和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PEPCK）的抑制提高了脂质产量。

其他代谢途径

其他工程努力包括1,6-β-转糖基酶TGS1和UGP过表达提升储存多糖，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶过表达增加甾醇中间体，异源5-组氨酸半胱氨酸亚砜合酶OvoA表达提升治疗性卵硫醇B产量。尽管岩藻黄素、脂肪酸和TAG代谢途径研究取得显著进展，微藻中许多生物合成途径仍待探索，可能蕴藏有价值的异源代谢物合成底物。

异源生物合成的合成生物学

合成生物学进展实现了多种异源化合物在三角褐指藻中的生产，涵盖药物、营养品和工业应用。

萜类

密码子优化的植物酶实现了香叶醇（驱避剂）和桦木醇（抗病毒三萜）的从头合成，其中桦木醇生产已放大至550升光生物反应器PBRs，向工业转化迈出关键一步。大麻 cannabinoid 生物合成途径的重构通过表达四酮体合酶和橄榄酸环化酶成功生成橄榄酸，产量范围0.56-2.6 mg/kg。尽管基因组稳定性在12个月内保持无序列重排，但连续培养6个月后橄榄酸检测不到，凸显了代谢途径优化以提升产物稳定性的必要性。最近研究通过异源表达黄色荧光蛋白标记的大麻二酚酸合酶CBDAS合成大麻二酚酸CBDA。在测试策略中，用三角褐指藻HASP1信号肽替换大麻CBDAS天然信号肽的嵌合酶显示出最高荧光强度，表明表达效率提升。

植物源萜类如紫杉醇和青蒿素广泛用于癌症和疟疾治疗。通过微生物平台生物合成这些化合物成为研究热点，目标是大幅降低生产成本并提高产量。与其他硅藻类似，三角褐指藻拥有甲羟戊酸MVA和MEP途径，能够合成通用萜类前体异戊烯基二磷酸IPP和二甲基烯丙基二磷酸DMAPP，相比传统微生物宿主如大肠杆菌和酵母具有显著优势。这些特征使三角褐指藻有望通过合成生物学策略成为复杂萜类完全生物合成的平台。

治疗性蛋白、糖工程与抗菌肽

诱导型启动子实现了SARS-CoV-2和乙肝表面抗原的生物合成，展示了三角褐指藻应对新发病原体的潜力。该硅藻被工程化生产靶向乙肝病毒表面蛋白的分泌型和非分泌型人IgG抗体CL4mAb。三角褐指藻的推定GDP-L-岩藻糖转运体恢复了哺乳动物缺陷突变体的岩藻糖基化，岩藻糖基转移酶的表达促进了岩藻糖基化糖蛋白生产，可能解决治疗兼容性问题。分泌型和细胞内抗菌肽（包括铁调素hepcidin、囊gonadin、S-thanatin和牛乳铁蛋白）被合成并展示了对细菌病原体的广谱抑制活性。

可持续材料与环境修复

聚-3-羟基丁酸PHB作为可降解塑料原料，通过引入细菌途径（三个基因）在三角褐指藻中合成，使用乙酰辅酶A作为前体。在低磷条件下碱性磷酸酶1基因启动子诱导的转基因株系中检测到PHB，而组成型启动子驱动的突变体则未检测到。除生物产物合成外，三角褐指藻工程还扩展到环境修复。Ideonella sakaiensis的分泌蛋白能降解塑料聚对苯二甲酸乙二醇酯PET，PET水解酶在三角褐指藻中的异源表达通过替换细菌信号肽为碱性磷酸酶信号肽成功降解PET，显示出生态恢复的巨大潜力。由于三角褐指藻能轻松适应废水环境，它被用于从废水中回收无机营养物。通过表达异源降解相关蛋白降解复杂有机污染物的能力因此促进了其在环境修复中的应用。

底盘表征与优化

分子工具箱的扩展也推动了对三角褐指藻内源代谢途径的深入解析，为底盘优化奠定了基础。关键研究聚焦于鉴定该硅藻中营养吸收、环境应激适应、刺激感应和细胞发育的关键基因。

营养吸收

碳同化涉及质膜定位的溶质载体SLC4型碳酸氢盐转运蛋白家族，PtSLC4-1在低CO₂条件下占主导。PtSLC4-1和PtSLC4-4的过表达增强了培养基中的碳同化。类囊体腔定位的θ-碳酸酐酶对生长至关重要，其敲降损害光合作用。两种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC异构体展现不同作用：PEPC2敲除突变体在低CO₂下显示生长缺陷，而PEPC1 disruption无影响。磷获取依赖SLC34转运体和碱性磷酸酶。PtSLC34-5和碱性磷酸酶敲除破坏了磷酸盐吸收。硝酸还原酶对硝酸盐利用必不可少，TALEN介导的硝酸还原酶敲除尽管正常吸收但无法在硝酸盐上生长。液泡硝酸盐转运体调节氮存储，CRISPR/Cas9敲除导致细胞内氮积累和生长抑制。细胞内PhoD型碱性磷酸酶不仅清除有机磷还与光合过程相互作用，其敲除在磷充足条件下增强了色素含量、光合效率和脂质积累。钴胺素获取蛋白1控制维生素B₁₂吸收，过表达增强而敲除消除了此能力。

环境应激适应与刺激感应

三角褐指藻的最适生长温度为20°C，超过此阈值生长速率急剧下降，30°C下几乎无存活。理解其耐热机制和工程化因此可促进三角褐指藻培养的可扩展性，特别是在自养开放池系统中，户外温度波动使精确热控既技术挑战又经济成本高。近期研究鉴定了耐热性的关键分子参与者。热激蛋白HSP70A通过调节光合相关蛋白在高温胁迫下增强非光化学淬灭NPQ介导耐热性。PtHSF2过表达通过与细胞分裂周期蛋白45-like、光捕获复合体蛋白2和ATP结合盒转运体基因直接互作显著提高了30°C下的存活。隐花色素-光解酶家族成员CPF1贡献于热适应，其敲除破坏了营养吸收和细胞分裂，这些表型被CPF1互补拯救。线粒体替代氧化酶AOX在胁迫下维持线粒体和叶绿体间的能量平衡。AOX表达降低损害了光合作用、生长和应激韧性。热激转录因子HSF1由营养耗尽诱导，通过直接结合GPAT3和DXS启动子调节脂质和色素代谢。硅藻黄质脱环氧化酶沉默在波动光下削弱了NPQ，凸显了其光保护作用。光适应机制涉及质体 transmembrane 蛋白PTP和光特异激酶LSK，LSK和PTP的RNAi敲降扰乱了光适应。蓝光受体AUREO1作为转录因子调节光转换期间的基因表达，而TALEN生成的AUREO1a/1b敲除突变体揭示了它们在蓝光适应中的作用。

细胞发育

三角褐指藻中的细胞周期启动由硅藻特异细胞周期蛋白2 dsCYC2控制，其表达为光诱导。dsCYC2水平降低延长了光暗循环下的世代时间。bHLH-PAS蛋白RITMO1调节昼夜节律，其表达改变扰乱了细胞周期时序。形态可塑性（纺锤形、椭圆形和三辐射形）仍知之甚少，但铁蛋白过表达诱导椭圆形形态转变和应激适应。新基因Pt2015过表达改变形态并增强了对阿米巴样捕食者的抗性。尽管新的细胞生物学见解为下一步工程提供了宝贵基础，但三角褐指藻的生长和生物量积累落后于模式绿藻莱茵衣藻。这种性能差距源于对生物量积累关键生物过程（特别是光合作用和有机碳代谢途径）的机制理解不足。

当前挑战与未来方向

尽管三角褐指藻在可持续生物生产中前景广阔，但关键瓶颈阻碍了其可扩展性。这些包括不令人满意的产物产量（可能由低异源蛋白表达、遗传不稳定性和转基因沉默引起）以及有限的生物量生产率。多基因香草素生物合成途径的附加体递送导致酶丢失和序列重排，而依赖报告基因与意外基因组突变相关。此外，大多数研究至今聚焦于单基因途径，而紫杉醇等高价值化合物需要协调表达数十个基因。尽管实验室规模的成功展示了潜力，放大努力受成本密集型生产和政策挑战的制约。解决这些瓶颈不仅需要合成生物学技术的进步（如改进遗传工具和底盘优化），还需要工业过程的全面改进，包括培养策略、成本效益放大和监管合规。

增强异源蛋白表达

密码子优化仍是改善转基因表达的基础策略，Watts等综述的工具使序列定制与三角褐指藻密码子偏好对齐。除此之外，转录和表观遗传优化代表了具有显著潜力的未充分探索途径。内含子已显示在微藻中增强基因表达，如在莱茵衣藻中所示。然而，在三角褐指藻中使用FBAC2、TUFA和RPS4内含子的类似研究未能显著改善抗生素抗性，表明物种特异性调控机制。同样，5'非翻译omega前导序列和Kozak共识基序（真核生物翻译起始关键）在其他系统中改善了表达，但在硅藻研究中仍未充分利用。DNA甲基化（由甲基转移酶如DNMT1介导）在微藻中抑制转基因。在三角褐指藻中，DNMT5敲除减少了甲基化并上调了转座子，表明表观遗传工程作为增强转基因表达的可行策略。莱茵衣藻中的平行研究表明，失活DNMT1提高了异源蛋白产量。此外，遗传绝缘子如支架/基质附着区域S/MARs可屏蔽转基因免受沉默，如在拟南芥中所证明。植物中绝缘子鉴定的方法总结可指导硅藻中的类似努力，实现精确稳定的转基因表达同时减轻沉默风险。

叶绿体作为亚细胞表达平台

三角褐指藻质体基因组（32.56% GC，130个蛋白编码基因）相比核转化具有优势，包括最小表观沉默和精确同源定向整合。莱茵衣藻叶绿体已成功工程化生产多种生物产物，使用扩展的转基因元件工具箱。值得注意的是，病毒复制子系统允许在烟草和莱茵衣藻叶绿体中稳定维持附加体转基因而无质体基因组整合，绕过了分离工程化和野生型质体基因组的需要。在三角褐指藻中，叶绿体表达协议于2014年建立，其中侧翼>1 kb同源臂的基因成功表达。乙酰辅酶A羧化酶PtACC2的叶绿体转化方法使脂质生产增加1.77倍。近期三角褐指藻质体基因组在酵母中的组装开辟了合成叶绿体工程的新途径，尽管工具箱限制仍是障碍。

位点特异性插入

通过CRISPR/Cas9产生位点特异性DSB的最新进展解锁了硅藻中的靶向基因组整合（敲入），利用同源介导插入在DSB位点的提升效率。这种方法实现了转基因精确整合到预定基因座，最小化宿主基因组干扰和表观沉默，这一策略正在彻底改变植物和微藻菌株工程。CRISPR/Cas9介导的HDR在三角褐指藻中通过整合带1 kb同源臂的供体DNA实现了靶向抗生素抗性。注意到较短同源臂（30 bp）足以在莱茵衣藻中进行精确C端YFP标记，表明硅藻系统可能需要类似优化。然而，在DSB生成后修复中，非同源末端连接NHEJ主导 over HDR。在莱茵衣藻中，抑制NHEJ关键酶DNA连接酶IV或过表达HDR相关基因（如酵母RAD54）提高了HDR效率。在三角褐指藻中，DNA连接酶IV（关键NHEJ酶）的敲降改善了HDR。尽管有这些进展，位点特异性整合仍技术挑战，特别是对于大多基因片段。

稳定高水平异源表达的关键决定因素是将外源DNA整合到转录活跃基因组基因座（“热点”）。例如，人基因组中随机GFP整合鉴定了热点区域，实现可预测的高转基因表达而无干扰相邻基因。这些基因座位点特异性整合的荧光强度比随机整合高近四倍，突出了它们的效用。类似地，将转录组数据与通过定量报告体的实验验证整合可绘制三角褐指藻中的热点基因座。理想情况下，多基因簇（由严格调控的启动子驱动）可整合到三角褐指藻基因组中的绝缘热点区域，实现稳定高产的异源基因表达和代谢物生产。

生长增强

生长优化策略包括异源表达莱茵衣藻质体蓝素，在铁限制下改善了三角褐指藻的光合效率。小球藻己糖/H⁺同向转运体在低光下增强了混合营养生长，而线粒体PEPC过表达优化了TCA循环，提升了生物量和光合作用。人葡萄糖转运体基因Glut1的表达赋予野生型菌株利用葡萄糖的能力，在混合营养和异养条件下促进了生物量积累。同时表达Glut1和来自酿酒酵母或Chromochloris zofingiensis的6-磷酸果糖激酶基因进一步增强了生物量生产率和葡萄糖-6-磷酸积累。在此研究中，转化子在混合营养下实现了超过1 g/L/d的生物量生产率，最大浓度6.5 g/L。然而，此性能仍落后于莱茵衣藻，其达到超过40 g/L的生物量浓度和5.85 g/L/d的生产率。尽管有这些进步，三角褐指藻的生长限制仍然存在。为解决此问题，物种改进努力应优先工程化光合作用、有机碳利用和营养吸收速率以进一步增强生物量积累。此外，生物量生产率还取决于全行业过程的进步，包括培养策略、过程控制、PBR开发和收获。

培养策略、成本分析与监管合规考虑

户外中试规模三角褐指藻培养试验主要依赖自养系统在批式或半连续模式，实现低于3 g/L的生物量浓度，显著低于实验室观察到的混合营养条件。支持混合营养培养并展示增强光穿透的成本效益PBRs因此可促进生物量积累的增加。三角褐指藻生物量的全面成本分析由于大规模培养数据有限而稀缺。技术经济评估估计在1公顷规模离心基收获的PBRs中交替培养三角褐指藻和等鞭金藻的生产成本超过100欧元/kg。生产成本高度案例特定，受变量如生物量生产率、培养策略、收获方法和地理位置影响。然而，生物量优化、PBR设计、收获技术（如超滤或生物絮凝）和放大努力的进步预计将显著降低成本，增强经济可行性。监管挑战进一步复杂化了三角褐指藻的商业化。欧洲食品安全局EFSA BIOHAZ小组拒绝授予三角褐指藻合格安全推定QPS status， due to其报道合成神经毒素β-N-甲基氨基-L-丙氨酸BMAA的能力和缺乏食品链中 documented 安全使用历史。尽管在中国列为饲料成分，三角褐指藻生物量必须证明未检测到BMAA水平。因此，BMAA水平必须在三角褐指藻衍生生物量和生物产物中严格监控以确保监管合规。此外，涉及三角褐指藻转基因菌株的应用也受严格全球政策 governing 转基因微生物。

总之，海洋三角褐指藻凭借其相对于其他成熟底盘的独特优势，可作为光合和生态友好的替代品。遗传工具的进步，包括转基因元件、基因组编辑以及转化方法，正将三角褐指藻定位为有前景的海洋细胞工厂，用于生产内源和异源生物产物，同时促进底盘表征和优化。然而，关键挑战如低生物产物和生物量产量以及禁止性高生产成本需要工程技术创新（如表观调控、叶绿体工程和精准基因组编辑）和培养策略、设备、收获和监管合规进步的协同解决。集体应对这些关键挑战可解锁高价值化合物的可扩展生产，满足全球需求的可持续生物制造。