利用CRISPR/Cas9与Cas12a双重系统实现番木瓜高效基因组编辑及育种应用

本研究针对番木瓜生产中面临的病原体威胁及天然遗传变异有限的问题，开发了基于CRISPR/Cas9和Cas12a的基因组编辑系统。通过农杆菌介导的胚性愈伤组织转化，成功实现对CpPDS和CpMLO6基因的高效编辑，获得高达90%以上的indel突变率，并产生纯合/双等位基因突变体。该技术为番木瓜功能基因组研究和抗病育种提供了可靠工具。

　　

番木瓜（Carica papaya L.）作为重要的热带经济作物，在食品、化妆品和制药行业具有广泛应用价值。然而其生产长期受到多种病原体的严重威胁，包括番木瓜环斑病毒（PRSV）、疫霉菌（Phytophthora palmivora）和白粉病等。更严峻的是，番木瓜天然遗传变异有限，传统育种手段难以实现品种改良。此前虽已通过转基因技术获得抗PRSV品种，但对其他病害的抗性育种仍进展缓慢。这种困境促使研究者转向基因组编辑技术，试图通过精准基因操作突破育种瓶颈。

为建立高效的番木瓜基因组编辑体系，研究人员采用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a（Cpfl）两种系统，分别靶向番木瓜的八氢番茄红素脱饱和酶基因（CpPDS）和白粉病感病基因（CpMLO6）。CpPDS是类胡萝卜素生物合成途径的关键基因，其突变会导致白化表型，是理想的编辑效果指示基因；CpMLO6则是潜在的感病基因，其编辑可能赋予白粉病抗性。

研究团队对夏威夷主要栽培品种'Kapoho'进行操作，关键技术方法包括：通过优化胚性愈伤悬浮培养体系建立转化受体系统；利用农杆菌介导法将五种编辑载体（分别表达单/双gRNA的Cas9或Cas12a构建体）导入番木瓜；采用G418替代卡那霉素进行抗性筛选；通过体细胞胚胎发生和器官发生途径再生完整植株。

研究结果首先证实了gRNA的有效性。通过体外切割实验筛选出7个高效gRNA（表1），其中Cas9系统针对CpPDS的sg16和sg379、针对CpMLO6的sg254和sg439；Cas12a系统针对CpPDS的cr423rc和针对CpMLO6的cr292rc、cr535均显示明确切割活性（图1）。研究人员成功构建了相应编辑载体（图2），其中pKSE401-Cas12a为首次开发的适用于双子叶植物的Cas12a表达载体。

转化体系优化取得显著进展。通过降低蔗糖浓度（30 g/L）显著提高胚性愈伤诱导效率（图3）；改进生根程序（无激素预培养→IBA处理→恢复培养）使生根率提升至50%；使用替门汀（timentin）有效控制农杆菌过度生长；整个再生周期缩短至7个月（图4）。

基因编辑效率令人瞩目。CpPDS编辑成功产生白化苗（图5），Cas9系统在sg379位点突变率达97-99%，获得12 nt缺失纯合突变体；Cas12a系统在cr423rc位点突变率超90%，但cr253位点未检测到突变（表2）。CpMLO6编辑中，Cas9系统双靶点同时突变率达100%，sg439和sg254位点突变率分别为93-100%和68-99%，获得多种纯合突变类型（表3）；Cas12a单gRNA系统也高效产生突变，cr535和cr292rc位点分别获得4 nt缺失纯合突变体和双等位基因突变体（图6）。

研究结论表明，本研究成功建立了番木瓜CRISPR/Cas9和Cas12a基因组编辑技术体系。该体系具有以下突出优势：编辑效率高（多数突变率>90%）；可同时实现多基因编辑；Cas12a系统拓展了AT富集区的编辑能力；首次开发的pKSE401-Cas12a载体为双子叶植物编辑提供新工具；优化后的转化体系显著提高再生效率。值得注意的是，T0代即获得纯合/双等位基因突变体，意味着通过自交可获得无转基因成分的编辑植株，这对番木瓜育种具有重要实践价值。

该研究的科学意义在于：为热带木本果树提供了高效基因组编辑范例；建立的技术平台可用于番木瓜功能基因组研究和重要农艺性状改良；特别是为解析番木瓜性别决定机制和抗病育种提供了关键技术手段。随着基因组编辑技术在作物改良中的应用日益广泛，本研究成果将为番木瓜及其他热带作物的遗传改良开辟新途径。