STING介导的抗病毒反应：揭示MVA在禽类细胞中复制调控机制及其对痘苗病毒疫苗生产的启示

本综述深入探讨了STING（干扰素基因刺激因子）信号通路在禽类成纤维细胞中调控改良型安卡拉痘苗病毒（MVA）复制的关键作用。研究通过CRISPR-Cas9技术构建STING敲除（KO）细胞模型，证实STING缺失会削弱I型干扰素（IFN-I）反应及下游干扰素刺激基因（ISG15、IFITM3）表达，从而显著增强MVA早期/晚期基因转录、DNA复制及病毒颗粒成熟。该发现为优化痘病毒疫苗载体生产提供了重要策略依据。

　　

STING knockout cell line generation and characterization

为探究cGAS-STING信号通路在MVA感染中的调控作用，研究团队通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了鸡STING基因敲除细胞系（DSK）。针对STING基因第三外显子设计的两条向导RNA（gRNAs）被克隆至PX458载体，该载体同时表达Cas9蛋白与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签。经共转染与有限稀释筛选，获得携带杂合突变（等位基因1：单碱基缺失；等位基因2：107 bp缺失）的DSK克隆。测序证实突变导致STING蛋白功能结构域（包括丝氨酸366位点及内质网转膜结构域）完全缺失。定量PCR（qPCR）使用针对缺失区域（外显子4）的引物对进一步验证了STING转录水平显著下调，表明DSK细胞中STING功能完全丧失。

Disruption of the STING gene enhances MVA viral growth

通过感染表达HcRed荧光蛋白的MVA病毒（MVA-red）评估STING缺失对病毒增殖的影响。免疫测定法显示，感染72小时后DSK细胞的感染单位/细胞（ifu/cell）产量较野生型（DF-1 WT）提高1.6倍。时间进程实验（24/48/72小时）证实该增殖优势持续存在。病毒基因组定量（qPCR检测E9L基因）表明感染早期（24小时）DSK的病毒颗粒/细胞（vp/cell）浓度更高（1.9倍），而后期趋于持平。病毒颗粒/感染单位比值（vp/ifu）分析揭示DSK细胞在感染后期具有更高感染性。流式细胞术检测显示：高感染复数（MOI 10）下，DSK细胞在感染6小时即呈现更高感染细胞比例；低MOI（0.03）感染后期（24/48小时），DSK细胞不仅感染细胞比例更高，平均荧光强度（MFI）也显著提升，表明STING缺失同时促进病毒早期基因表达与晚期成熟过程。

Early and late MVA gene expression is enhanced in DSK-infected cells

为解析STING对病毒复制周期的具体影响，研究检测了MVA早期基因（E3L、K1L、F1L）和晚期基因（B16R、D8）的转录动力学。qRT-PCR分析显示：在DSK细胞中，所有早期基因表达均更早达到峰值（30-60分钟），且表达量显著高于WT；晚期基因表达在感染后2-4小时同样显著增强（B16R峰值在3小时，D8在4小时）。该结果证明STING缺失通过增强早期基因转录加速病毒复制进程。

The lack of STING influences MVA DNA replication

基于痘病毒早期基因表达与DNA复制的紧密关联，研究通过显微镜观察同步化感染后病毒复制中心形成情况。结果显示：DSK细胞在感染60分钟即出现可见复制中心（WT需90-120分钟），且90分钟时DSK细胞复制中心数量更多、尺寸更大，至120分钟达到峰值。定量分析证实DSK细胞单位核内复制中心数量显著高于WT，表明STING通过调控DNA复制效率限制病毒增殖。

Analysis of STING downstream gene expression upon MVA infection

STING下游效应分子表达分析揭示：感染4小时后，DSK细胞中I型干扰素（IFNα/IFNβ）转录水平显著低于WT。干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFITM3，可抑制痘病毒胞质入侵）及干扰素刺激基因15（ISG15）在WT细胞中明显上调，而在DSK细胞中无显著变化。值得注意的是，髓样分化因子88（MyD88）和干扰素调节因子1（IRF1）在DSK细胞中被MVA感染显著诱导，表明在STING缺失背景下，TLR信号通路可能通过MyD88/IRF1轴补偿性激活以维持部分免疫应答。

DISCUSSION

本研究系统阐明了STING通路在禽类细胞中限制MVA复制的多重机制：① 通过调控I型干扰素及ISGs（IFITM3、ISG15）建立抗病毒状态；② 抑制病毒早期基因转录与DNA复制起始；③ 干扰病毒颗粒的后期成熟与感染性。特别发现STING缺失会触发MyD88/IRF1替代性通路激活，提示细胞存在信号通路代偿机制。与哺乳动物BHK21细胞中STING不影响MVA复制的报道相比，本研究突出物种特异性应答差异，为禽源细胞平台优化痘病毒疫苗生产提供关键理论依据。STING与IFITM3的相互作用可能通过内体途径靶向降解病毒颗粒，这为后续靶向STING增强疫苗载体产能指明方向。

MATERIALS AND METHODS

实验采用ATCC来源的DF-1细胞（鸡胚成纤维细胞）及自建DSK细胞系，培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。MVA-red病毒在DF-1细胞中扩增，于Vero细胞通过免疫染色法滴定。基因编辑使用PX458载体系统，转染采用Lipofectamine 2000试剂。基因组DNA提取用DNeasy试剂盒，突变检测通过特异性PCR扩增与Sanger测序。病毒基因组定量采用TaqMan探针法（靶标E9L基因）。流式细胞术使用BD FACS Canto II平台，死细胞染色采用Near-IR染料。免疫荧光通过甲醛固定、Hoechst核染色及激光共聚焦显微镜（LEICA DMi8）成像。RNA提取使用Direct-zol试剂盒，cDNA合成采用SuperScript IV系统，qRT-PCR使用SYBR Green法，引物序列见附表。统计学分析采用非配对t检验，以P<0.05为显著标准。