基于微球的CRISPR诊断技术：提升灵敏度与多重检测能力的创新策略

本研究针对CRISPR诊断技术在报告系统和反应平台方面的不足，开发了两种基于微球的创新方法：bbLuc系统通过裂解荧光素酶互补报告系统将检测灵敏度提升20倍；bbCARMEN平台利用彩色编码微球实现九种呼吸道病毒的多重检测，灵敏度达2.5拷贝/μl。这些技术显著提高了CRISPR诊断在资源有限环境的适用性。

　　

在COVID-19大流行的背景下，全球对快速、准确且可现场部署的病原体检测技术需求迫切。虽然定量PCR（qPCR）作为金标准具有高灵敏度，但其设备要求高、耗时长且需要专业操作；而抗原检测虽易于部署，但灵敏度和特异性较差。CRISPR技术凭借其特异性靶向识别和 collateral cleavage（旁路切割）活性，为分子诊断提供了新思路，但现有系统大多依赖荧光或侧流层析读出，在报告系统设计和反应平台构建方面仍有较大发展空间。

为了突破这些限制，研究团队开发了两种基于微球的创新平台：bbLuc聚焦提升单重检测的灵敏度，bbCARMEN则致力于实现低成本、高通量的多重检测。研究发表于《Nature Biomedical Engineering》，通过系统性优化与临床验证，显著推进了CRISPR诊断技术的实用化与可及性。

研究采用的主要技术方法包括：1）基于微球的裂解荧光素酶报告系统（bbLuc），通过SPAAC点击化学连接RNA linker与HiBiT肽；2）重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas13检测的一体化反应体系；3）彩色编码微球与crRNA偶联技术，实现多重靶标识别；4）微流控液滴生成与荧光显微成像分析系统；5）临床样本验证使用RT-qPCR（CDC推荐方案）和NGS作为金标准，样本来源包括尼日利亚现场采集的呼吸道样本及美国生物样本库的存档样本。

Coupling Cas13 activity to a split nanoluciferase readout

研究团队首先设计了一种基于微球的裂解荧光素酶报告系统（bbLuc），将HiBiT和LgBiT亚单位分别偶联至不同微球，通过Cas13切割RNA linker释放HiBiT，使其与LgBiT互补形成活性荧光素酶。通过优化linker长度与连接化学（SPAAC法），并调整微球表面肽密度至300 nM，在无扩增条件下实现20倍灵敏度提升，检测限达5×10⁸拷贝/μl。

Integration of luminescent reporter into SHINE

将bbLuc与等温扩增平台SHINE整合时，发现RPA中的单链结合蛋白（SSB）会抑制Cas13切割效率。通过筛选27种linker设计，最终采用2-hexapeg14U linker，并优化furimazine浓度（150 μM）和RPA引物浓度（60 nM），使bbLuc SHINE在75分钟内检测限达到32拷贝/μl。临床样本测试显示，bbLuc SHINE较荧光SHINE多检出3例低病毒载量阳性样本，灵敏度达89.7%。

Single-timepoint luminescence readout in SHINE

通过延迟添加furimazine并提高其浓度，实现了单时间点读出，兼容便携式发光仪甚至智能手机成像。在尼日利亚的现场验证中，bbLuc SHINE在60分钟内检出全部12例阳性样本，而荧光SHINE仅检出3例。

Equipment-free bead-based droplet generation for multiplexed fluorescent Cas13 detection

bbCARMEN利用彩色编码微球偶联crRNA，通过3′端生物素化实现高效Cas13激活。微滴生成无需专业设备，仅需振摇即可形成纳升级反应单元，每个微滴包含一个crRNA微球和检测主 mix。

Respiratory virus panel implementation on bbCARMEN

在九重呼吸道病毒panel（RVP）测试中，bbCARMEN对SARS-CoV-2和HCoV-HKU1的检测限达2.5拷贝/μl，其他病毒检测限在5-40拷贝/μl之间。临床样本验证显示，97.9%的SARS-CoV-2阳性样本和93.3%的HRSV阳性样本被准确检出。

Automated readout of bbCARMEN using commercially available consumables and equipment

通过将微滴加载至48孔板并采用酶标仪成像，实现了与定制显微系统100%的一致性，显著降低了设备与操作复杂度。

研究结论强调，bbLuc和bbCARMEN分别代表了CRISPR诊断在单重灵敏度提升和多重检测能力拓展方面的重大进展。bbLuc通过生物发光读出克服了荧光背景高的局限，且无需激发光源，更适合资源有限环境；bbCARMEN则通过微球编码和微滴反应实现了低成本、高通量的多重检测，为现场筛查提供了可行方案。这些技术为未来应对新发病原体和变异株检测提供了可扩展的平台，但仍需在核酸提取简化、操作流程优化方面进一步探索。该研究为CRISPR诊断技术的实际应用奠定了坚实基础，推动了分子诊断向更灵敏、更便捷、更经济的方向发展。