综述：重写脚本：血管性血友病的基因治疗与基因组编辑

本综述系统探讨了基因治疗与CRISPR-Cas基因组编辑技术在血管性血友病（VWD）治疗中的前沿进展。文章深入分析了VWD的分子遗传机制（如VWF基因突变多样性）、当前治疗局限（如DDAVP和替代疗法的不足），并重点评估了等位基因选择性siRNA沉默、碱基编辑（BE）、引物编辑（PE）及同源定向修复（HDR）等策略的潜力与挑战。同时，详细比较了AAV、LNP、LV等体内递送系统靶向内皮细胞（ECs）的可行性，为开发个性化、持久性VWD疗法提供了重要见解与方向。

　　

1 血管性血友病（VWD）概述

血管性血友病（Von Willebrand Disease, VWD）是最常见的遗传性出血性疾病，其在普通人群中的患病率估计为每百万人25.6例。患者存在von Willebrand因子（VWF）的质和/或量的异常，这是一种在初级止血过程中至关重要的大型多聚体蛋白。VWD可分为不同类型，其严重程度各异。1型VWD最为常见，患者循环中的VWF减少，表现为轻度出血表型。若VWF减少是由于清除增强所致，则被描述为1C型VWD。2型VWD的特征是VWF的质量缺陷，可进一步分为多种亚型：A、B、M和N。其质量损伤范围从VWF二聚体多聚化为具有止血活性的成熟VWF多聚体不足，到与其他参与维持止血的蛋白质的结合受损和易感性改变。3型是最罕见但最严重的形式，患者循环中的VWF水平几乎检测不到，并经历严重的出血表型。

VWD的不同类型通常源于影响VWF不同结构域的突变。目前，已知超过750种独特的致病性VWF突变，导致一系列出血并发症，包括皮肤黏膜出血、月经过多、关节出血、胃肠道出血和手术期间出血。仅莱顿开放变异数据库（LOVD）就报告了505种在临床VWD患者中发现的VWF变异，其中约450种是错义和无义变异。利用LOVD数据库中的这些变异作为示例，可以说明VWF变异的分布情况。导致1型和3型VWD的变异可见于VWF全长。相反，2型VWD变异通常位于A1结构域周围，影响与血小板和/或胶原的结合，或位于D’D3或CK结构域周围，影响多聚化。更多VWF变异已被多项研究报道，并可在其他数据库中找到，如ClinVar、GnomAD、基因组浏览器、人类基因突变数据库（HGMD）等。尽管VWD亚型的患病率因数据库和队列而异，多项研究表明，1型VWD是迄今为止最常见的形式，约占VWD病例的60%–85%。2型VWD是第二常见的，患病率为15%–45%。Orphanet估计全球1型VWD的患病率为1–5/10,000，全球2型VWD的患病率为1–9/1,000,000。3型VWD仍然是该病最罕见的形式。

尽管约30%的患者中未发现VWF的致病性突变，但VWD通常被认为是一种单基因疾病。检测VWF中致病变异的位置可能暗示受损伤的结构域和蛋白质的结合位点，从而暗示损害VWF的潜在分子机制。然而，在VWF中发现的大多数变异尚未得到充分表征，因此被归类为意义不明确的变异（VUS）。为了阐明这一点，研究对大量患者群体进行了测序，并进行了体外表征实验，以探索哪些VWD变异是真正致病性的。

1.2 VWD的遗传

VWD主要作为常染色体显性遗传病遗传，大多数VWF变异是杂合错义突变。这主要导致VWD 1型和2型亚型，而3型和2N型通常源于纯合无效突变或复合杂合，因此是VWD的较罕见形式，具有典型的隐性遗传模式。3型的患病率约为1:250,000至1:1,000,000，但由于在近亲结婚更常见的地区患病率增加，难以确定。

1.3 初级止血的核心：von Willebrand因子（VWF）

在VWD中，可能存在VWF的定量或功能缺陷：这是一种由内皮细胞（EC）和巨核细胞产生的大型多聚体蛋白。长的VWF链主要分别存储在内皮细胞的Weibel-Palade体（WPB）和血小板的α-颗粒中。在ECs中合成后，VWF被转运至内质网（ER），在此处VWF信号肽被移除，并通过CK结构域在VWF单体之间发生C端二聚化。二聚体随后被穿梭至高尔基体，其中Furin将VWF前肽（VWFpp）从二聚体上切割下来，使其能够通过N端D’D3结构域进行多聚化。重要的是，VWFpp仍然非共价地与VWF多聚体结合，这对于VWF多聚体 trafficking 和包装进WPBs至关重要。这些细胞器存储超大（UL）和高分子量（HMW）VWF多聚体，在内皮激活时分泌到血流中。同时，低分子量（LMW）VWF通过称为组成型分泌的过程由ECs持续分泌。VWF的第三条分泌途径是WPBs的未刺激融合及其在基础分泌期间的内容物释放。基础分泌的VWF被认为是血浆中稳定VWF水平的主要贡献者。分泌后，UL和HMW VWF链经受ADAMTS13的切割，产生不同大小的独特多聚体模式。巨核细胞中VWF的生物合成也导致HMW VWF多聚体的形成，这些多聚体最终存储在血小板α-颗粒的管状亚区室中。

在血浆中，VWF作为FVIII的伴侣蛋白，保护其免受清除和蛋白水解切割。在血管损伤部位，VWF通过其A3结构域与暴露的内皮下胶原层结合，锚定自身并展开以暴露其血小板结合位点。展开的VWF链为血小板通过其糖蛋白Ibα（GPIbα）受体与A1结构域结合提供了一个平台，启动血小板栓的形成。这完成了称为初级止血的过程。由于VWF的多功能作用及其包括多个结合位点的复杂结构，VWD表型的多样性并不令人惊讶。VWF的缺陷会影响参与凝血的其他蛋白质，并且治疗和预防由错误或缺失的VWF引起的出血具有挑战性。

1.4 VWD的当前治疗

大量致病性变异和疾病机制使VWD的治疗变得极其复杂。此外，对疾病根本原因的了解不足目前阻碍了临床中的个性化治疗。当前的治疗旨在在出血事件发生时或干预前后按需增加VWF和FVIII血浆浓度。VWD患者，特别是1型患者的一个常见治疗方法是刺激ECs释放储存的VWF和FVIII来增加循环VWF和FVIII水平。这是通过给予去氨加压素（DDAVP）来实现的，它是激素加压素的合成版本，与ECs的V2R受体相互作用以刺激VWF释放。然而，并非所有VWD患者都对DDAVP有反应，并且DDAVP给药在2B型VWD患者中是禁忌的，因为他们的VWF对血小板的亲和力增加，导致血小板减少的风险增加。此外，3型VWD患者无法从DDAVP中受益，因为ECs没有可释放的储存VWF。根据ASH ISTH NHF WFH 2021 VWD指南，必须对可能选择此方案的患者定期测试DDAVP，并根据这些试验结果调整治疗。

对于无反应的患者或在DDAVP不足的大手术中，替代疗法是使用VWF（FVIII）因子浓缩物。替代疗法用于管理急性出血以及长期预防严重受影响VWD患者的出血。后者患者每周接受2-3次静脉注射因子浓缩物（即所谓的预防性治疗）。血浆源性VWF浓缩物和重组VWF（rVWF）均可有效停止和预防出血。抗纤溶药物氨甲环酸主要用作DDAVP或VWF浓缩物的辅助治疗。

总而言之，现有有效的疗法可用于VWD患者。然而，VWF浓缩物需要由医疗保健专业人员静脉注射，因此需要去医院。特别是在严重受影响的患者中，如接受长期预防性治疗的VWD 3型患者，定期去医院降低了他们的生活质量。此外，浓缩物成本高昂，并且由于需要终身治疗，对社会造成了金钱负担。因此，当前的治疗并非最优，持久的治疗方法对于减轻VWD患者的疾病负担是理想的；使他们能够更多地参与日常活动而减少担忧。因此，需要替代性和创新性疗法来优化VWD的治疗。

2 使用小干扰RNA（siRNA）沉默杂合VWD患者的突变VWF

RNA干扰（RNAi）是一种通过互补的短干扰RNA（siRNA）分子靶向降解mRNA的机制。在血友病患者中，靶向抗凝血酶的siRNA已被广泛研究，目的是恢复止血平衡。接受这种siRNA治疗的患者显示凝血酶生成正常化且出血次数减少。类似的方法可用于杂合VWD患者，其中siRNA靶向突变的致病等位基因。如上所述，约33%的VWF突变导致质量损伤，导致2型VWD。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，siRNA介导的VWF敲低可在转录水平实现90%的减少。De Jong等人通过将靶向突变VWF mRNA的siRNA封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中，增强了这种方法，在显性阴性2A型VWD模型中实现了等位基因选择性VWF降解。通过这种方法，他们利用患者来源的静脉内皮集落形成细胞（ECFCs）在体外证明了VWD 2A型表型中VWF内质网滞留的解决。该siRNA被设计为靶向一个非致病的、常见的杂合单核苷酸多态性（SNP），该SNP与编码显性阴性VWD变异的致病突变共分离。然后，通过杂交两种不同的小鼠品系B6和129S，创建杂合B6.129S模型，在小鼠中进一步探索了这一概念。该模型模拟了一种杂合 scenario，其中siRNA可以区分两个VWF等位基因中存在的单个良性SNP。随后，Linthorst等人研究了这种方法是否可以扩展到杂合VWD 2B小鼠模型。由此产生的突变VWF蛋白的选择性减少、改善的多聚体VWF模式以及三分之二杂合VWD 2B小鼠出血时间的正常化，突显了这种个性化治疗策略的潜力。靶向杂合SNP而非致病变异也允许更广泛的应用，独立于致病性VWD突变。De Jong等人确定了4个常见的SNP，其在普通高加索人群中的次要等位基因频率约为0.3。基于这些频率，他们计算出一个个体对至少其中一个SNP呈杂合的概率为74%。在另一项研究中，将WT和一种影响多聚化的显性阴性VWF变异质粒共注射到VWF^?/?小鼠中。然后通过后续siRNA注射抵消了VWF变异；在第二天证明了多聚化的改善。这种优雅的方法可能潜在地用于成功治疗一部分具有显性阴性2型VWD的患者。然而，siRNA并不能为VWD患者提供永久性解决方案，而是需要定期重新给药。siRNA在体内能发挥功能多久以及缓解疾病表型的效果，仍需要在大动物模型和人类中进行评估。

3 CRISPR-Cas技术

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白是保护其原核宿主免受入侵遗传元件侵害的适应性免疫系统。自2012年以来，各种Cas核酸酶已被重新用作下一代基因工程工具，取代了先前耗时且昂贵的技术，如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）。CRISPR-Cas系统分为两类、七型和若干亚型。2类系统因其简单的单效应蛋白（Cas9、Cas12和Cas13）架构而席卷了当前的基因组编辑应用，这与1类系统的多蛋白效应复合物性质形成对比。如今，最广泛使用的2类核酸酶是来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的II-A型Cas9（SpCas9）和来自毛螺菌科细菌（Lachnospiraceae bacterium）的V-A型Cas12a（LbCas12a）或酸土脂环酸杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）的V-A型Cas12a（AsCas12a）。Cas9和Cas12a核酸酶需要一个小向导RNA（gRNA）分子来结合到一个靶DNA序列（原型间隔区），该序列侧翼有一个短的、保守的基序（原型间隔区相邻基序；PAM），并创建一个双链DNA断裂（DSDB）。其他几种天然存在的Cas9或Cas12直系同源物及其工程变体也已被利用，丰富了当前的CRISPR-Cas工具箱。以下是不同CRISPR-Cas技术如何用于治疗和/或纠正VWD的概述。

3.1 基于DSDB的基因编辑：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）

有两种主要途径来修复由2类Cas核酸酶产生的DSDB：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ方法表现出高效率，因为它不依赖于细胞周期，并且在gRNA识别位点持续编辑，直到实现随机插入和/或缺失（INDELs），这通常阻止进一步的Cas:gRNA结合。相反，HDR引入精确的遗传修饰，需要DNA修复模板和分裂细胞。外源DNA模板的存在欺骗细胞在同源重组（HR）过程中利用外源模板进行修复，而不是姐妹染色单体。除了HDR的上述限制外，通常还观察到强烈的DSDB诱导的NHEJ背景。在VWD背景下，通过基因型和表型分析可以确认CRISPR诱导的修饰。下一代测序能够精确检测CRISPR引入的分子改变，而表型验证，例如通过患者来源的ECFCs的体外共聚焦显微镜观察到的改善的VWF合成或体内VWF血浆水平的变化，可以进一步证实成功的基因编辑。

3.1.1 非同源末端连接（NHEJ）

在哺乳动物细胞中，DSDB主要通过易错的NHEJ修复途径修复；由于小的INDELs导致移码和提前终止密码子（PTC）。Schillemans等人利用了这一方法，在脐带血（CB）ECFCs中使用慢病毒系统应用SpCas9生成克隆VWF敲除（KO）系。这项研究证明了Cas9在ECFCs中的有效性，并为进一步的体外患者来源的ECFC研究铺平了道路。

遵循与等位基因选择性siRNA靶向相同的原理，CRISPR-Cas技术可用于选择性破坏携带致病变异的突变VWF等位基因。在一项正在进行的研究中，我们通过靶向位于致病变异同一等位基因上的一个常见杂合SNP，在2A型和2B型VWD患者来源的静脉ECFCs中观察到了表型拯救。基于CRISPR的选择性沉默VWF致病等位基因方法的一个关键考虑因素是潜在的脱靶活性。特别是，gRNA对突变体和野生型等位基因的区分不足可能导致功能性等位基因的意外沉默。这种脱靶效应可能通过进一步降低功能性VWF的水平而加剧VWD的临床表型，而不是改善它。同时，需要确保选择性靶向ECs，以防止CRISPR构建体在不需要的组织中发生全基因组脱靶。作为额外的安全措施，可以利用EC特异性启动子来确保在体内非目标组织中的有限表达。然而，这种靶向策略是朝着永久拯救杂合VWD类型迈出的有希望的第一步，提供了高等位基因选择性，并限制了对健康等位基因的破坏。虽然等位基因选择性靶向方法，无论是使用siRNA还是CRISPR-Cas技术，在减轻突变VWF的显性阴性效应方面显示出有希望的结果，但单倍体不足的风险仍然存在，这在先前VWD 1型中已有报道。理论上，严重受影响的杂合VWD 2型患者在接受此治疗后可能转变为轻度1型VWD，从VWF的质量缺陷转变为数量缺陷。考虑到1型VWD患者通常较低的出血表型，这种转变预计将减轻疾病负担，从而提高这些患者的生活质量，而不是完全治愈他们。

CRISPR-Cas也被用于促进小鼠血管内皮的体内编辑。具体来说，Cas9在内皮特异性CDH5启动子的控制下从基于质粒的表达系统中表达。在视网膜后注射之前，将质粒封装在PP/PEI（PEG_5,000-b-PLGA/ PEI_25,000Da）纳米颗粒中，导致小鼠肺ECs中靶向Pik3cg的40%–45%的编辑，而在肺非ECs中未检测到INDELS。这项研究表明，将CRISPR-Cas特异性和靶向递送到ECs是可能的，并且基因靶向的选择性高度依赖于所使用的gRNA。因此，事先对高效和选择性gRNA进行彻底的体外分析至关重要，并且会极大地影响编辑百分比。

3.1.2 同源定向修复（HDR）

虽然那些基于NHEJ的方法是高效的，但NHEJ途径是一种易错的修复机制，并且编辑的结果并非完全可预测。相反，HDR提供了一种大多无错误的修复，改变了从几个到几千个碱基对（bps）的DNA区域。虽然HDR提供了一种更可控的编辑方式，但与NHEJ相比，效率大大降低。但该方法可以高度定制，例如，通过定制包括不同长度的同源臂（HAs），并且在单链DNA（ssDNA）模板的情况下，使用不对称的HAs。在HAs上包含截短的gRNA原型间隔区序列也被证明有助于提高HDR率，其原理是Cas9可以结合但不能切割HDR供体；由于Cas9核定位信号（NLS）的存在，允许其将供体运输到细胞核中。还有其他旨在提高HDR效率的策略。出于研究目的，已应用细胞同步剂和NHEJ抑制剂。虽然它们可以提高HDR率，但它们具有毒性，并且不适合治疗应用。最近一项关于AZD7648（一种抑制NHEJ的药物）的研究导致了易位和大型兆碱基缺失的增加，包括染色体臂的丢失。然而，染色体重排也在HDR期间自发发生，这是由于管理同源序列配对的不同途径的参与或过早终止的HDR修复。然而，CRISPR-Cas HDR技术的一个主要缺陷是其局限于S期和G2期，此时通常姐妹染色单体充当修复模板。因此，HDR仅限于分裂细胞，因此可能不是体内编辑内皮的最佳选择。插入全长VWF编码序列（～8.4 kb）的另一个限制是需要大的有效载荷大小，这会降低体内递送的效率。使用较短的供体模板靶向特定区域可能在插入效率方面更有利。在VWD中，外显子4和5的缺失已在大量VWD患者中被描述，并且将需要相当短的模板。当然，这种靶向外显子方法的代价是牺牲了可以治疗的更广泛的VWD患者群体，换取了可能实现更高校正程度的较小群体。鉴于这些技术的不成熟状态，我们不会进一步详细说明它们，但Villiger等人在他们的综述中详细讨论了替代CRISPR技术，我们推荐进一步阅读。总体而言，大片段编辑的新兴领域存在几个限制，包括表征不足、效率低、设计复杂、编辑器尺寸大、供体分子的共同递送以及不需要的序列疤痕。这些技术的优化可能为VWD解锁千碱基规模的基因治疗。

3.1.3 同源非依赖性靶向整合（HITI）

Suzuki等人部署的同源非依赖性靶向整合（HITI）代表了一种通过利用NHEJ途径进行供体DNA整合来提高基因插入效率的策略。这种方法旨在克服HDR效率低下的限制，特别是在非分裂细胞中。与依赖同源臂（HA）不同，供体DNA在一个或两侧包含极性相反的sgRNA结合位点。当这些位点被Cas9靶向时，可以导致供体模板的线性化及其随后在CRISPR-Cas9促进的DSB处整合到宿主基因组中。HITI对NHEJ的依赖提出了另一个限制，因为不能排除INDELs的发生，并且存在不需要的片段和反向整合的小风险。尽管HITI表现出高效率，特别是在非分裂细胞中，但其对VWD的普遍应用——像HDR一样——需要递送和整合完整的VWF编码序列（CDS）。该插入片段的巨大尺寸可能限制这种方法的整体效力。然而，对于携带VWF外显子缺失的VWD患者，HITI将是一种有吸引力的个性化编辑策略，因为它已被证明在多种遗传疾病中实现精确的DNA敲入，包括BCD患者来源的iPSCs和小鼠、血友病B大鼠模型和原代CD34⁺ HSPCs。

3.2 碱基编辑技术

DSDBs与不良后果有关，例如易位、复杂的产品混合物和p53的失活。CRISPR-Cas碱基编辑是一种有吸引力的基因编辑技术，因为它能够在不诱导DSDBs的情况下修饰核苷酸，尽管在某些情况下报告了意外的DSDBs导致基因毒性效应。该系统基于与（部分）失活Cas蛋白融合的脱氨酶。迄今为止，已经开发了 numerous 碱基编辑器，呈现出可变的效率、纯度、编辑窗口、相邻核苷酸偏好、特异性、可靶向性和大小。

两种主要类型的碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）。ABEs将腺嘌呤转化为次黄嘌呤，在DNA复制或修复过程中被读作鸟嘌呤。ABEs包含一个实验室进化的tRNA腺苷脱氨酶A（TadA）用于转化。最近的ABE变体ABE9呈现出高效率、特异性，并在1–2 bp的窗口内起作用。此外，Qin等人开发了一系列高效的ABE-Ultramax碱基编辑器（ABE-Umax），它们要么具有更宽和灵活的编辑窗口，要么具有1–2 bp的狭窄编辑窗口和增加的特异性。

CBEs将胞嘧啶转化为尿嘧啶，在DNA复制或修复过程中被读作胸腺嘧啶。为了防止尿嘧啶-DNA糖基化酶介导的尿嘧啶切除，通常至少一个尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）被融合到CBEs上。包含多个UGIs已被证明可以提高效率，但也增加毒性。因此，对于体内基因编辑，限制UGIs的数量至关重要。最广泛使用的CBE系统包含载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样（APOBEC）酶、海洋七鳃鳗（Petromyzon marinus）胞苷脱氨酶1（PmCDA1）及其工程变体。然而，最新的CBEs从ABEs的TadA进化而来，降低了脱靶概率。

除了ABEs（A>G）和CBEs（C>T）之外，还开发了其他碱基编辑器，例如CGBEs（C>G）、AYBEs（A>C或A>T）、gTBEs（T>C或T>G）、gCBE（C>G）、CABEs（C>A）和DBEs（C>T和A>G），进一步扩展了碱基编辑技术的适用性。然而，与ABEs和CBEs相比，它们目前表现出较低的转换效率和纯度以及较大的活动窗口，限制了它们在治疗应用中的使用。Xu等人和Wang等人最近的综述很好地总结了不同类别的碱基编辑器在精准医学中的应用。

在ECFCs中，B?r等人成功应用腺嘌呤碱基编辑作为VWD疾病建模的手段。通过慢病毒递送ABE8e-SpG编辑器，在健康的CB-ECFCs中安装了致病性VWF p.M771V点突变。嘌呤霉素选择富集后的靶向效率约为70%，在相邻碱基对上仅有最小的意外旁观者编辑（<2%）。在健康ECFCs中引入的患者突变模拟了患者来源的ECFC表型，使碱基编辑成为在原始细胞类型和基因天然启动子控制下研究患者突变的理想工具。基于这个概念，使用碱基编辑器精确纠正致病变异将是治愈VWD的理想策略。然而，除了体内尚未完全探索的副作用以及与小型编辑窗口定位相关的特定基因组要求之外，碱基编辑器的大小是一个显著的限制，我们将在有关递送的章节中进一步讨论。

碱基编辑器似乎是针对VWF中大多数致病变异的最合适的校正工具，因为大多数变异是点突变。对LOVD数据库中剪接、错义和无义变异的分析表明，原则上几乎一半的这些点突变理论上可以用ABEs纠正，而CBEs的理论靶向潜力约为20%。然而，致病性VWD变异的广泛异质性使碱基编辑成为一种很大程度上患者特异性的方法，由于开发突变特异性试剂的高成本，限制了其当前的可行性。虽然体内碱基编辑的临床试验正在进行中，但需要进一步评估它们对VWD基因治疗的适用性。

3.3 引物编辑技术

与碱基编辑器类似，引物编辑器（PEs）在没有DSDBs和供体DNA的情况下在靶双链DNA（dsDNA）上引入编辑。此外，PEs能够进行任何类型的单核苷酸修饰，包括点突变、小插入、缺失和替换，使其成为针对所有不能被BEs靶向的VWF变异的有效编辑工具。PEs由一个部分失活的Cas9或Cas12蛋白与一个逆转录酶（通常是鼠白血病病毒（Mouse-Moloney Leukemia Virus; MMLV）的突变变体）融合而成。代替向导RNA的标准间隔区-支架结构，引物编辑向导RNA（pegRNA）由间隔区、支架和额外的3′元件组成，包括引物结合位点（PBS）和逆转录模板（RTT）。当PE被间隔区引导到靶DNA位点时，它切割DNA，产生一个3′ DNA flap，然后与pegRNA上的互补PBS杂交。这作为使用RTT延伸序列的逆转录的起始点，RTT编码所需的改变。这个“编辑过的”DNA flap可以与基因组杂交，导致异源双链错配。编辑是否被纳入或移除取决于哪条链用于DNA修复。

尽管PEs由于三重检查点验证而呈现有限的脱靶编辑，但它们有几个限制因素，例如pegRNA 3′末端的降解和DNA错配修复（MMR）途径的抑制。已经开发了几种策略来绕过这些问题：

? 在所需靶点周围引入沉默突变有助于逃避MMR途径。

? 包含一个次要的标准20bp切割gRNA来切割未编辑的链，迫使细胞使用编辑过的链作为修复模板。这次要的切割gRNA可以在编辑位点或在短距离之外。

? 融合一个具有显性负效应的MHL1变体以损害MMR。MLH1是一种DNA错配修复蛋白。

? 在pegRNA上添加一个具有强二级结构的3′基序（称为epegRNA）以防止pegRNA上3′ PBS的降解。

? 将RNA结合外切核酸酶保护因子LA融合到PE上。LA与转录本3′末端的聚尿苷酸束相互作用，保护它们免受外切核酸酶的侵害。

PEs已被用于靶向人视网膜微血管ECs和小鼠血管ECs中的VEGFR-2基因。两种情况均利用双重慢病毒方法（包含次要切割gRNA和MMR抑制剂）实现了略高于50%的效率。对于VWD的应用，就像碱基编辑一样，引物编辑可能属于针对患者特定突变的个性化治疗；这目前降低了其适用性。

3.4 大片段编辑：转座子和整合酶基系统

尽管短序列编辑方法（NHEJ、HDR、