鉴定未表征蛋白作为十二指肠贾第鞭毛虫中贾第鞭毛虫病毒（GLV）感染的新型调控因子

本综述聚焦于贾第鞭毛虫病毒（GLV）与宿主十二指肠贾第鞭毛虫（G. duodenalis）间的复杂互作机制，首次揭示未表征蛋白（UCP）通过其糖基转移酶稳定（Gtf2）结构域直接结合GLV衣壳蛋白（GLVCP），调控GlcNAc介导的O-糖基化（O-GlcNAc）、抑制ATP转运并激活组织蛋白酶B（CTSB）对GLVCP的酶切，从而促进病毒基因组释放与生存。研究综合运用质谱、Co-IP、BiFC及CRISPR/dCas9基因编辑技术，填补了原生动物病毒-宿主互作领域的空白，为抗贾第虫感染策略提供新靶点。

　　

ABSTRACT

十二指肠贾第鞭毛虫（G. duodenalis）是一种常见的肠道原生动物寄生虫，是儿童和旅行者腹泻的主要病原体。虽然许多感染无症状，但可能导致儿童严重的营养不良和认知发育障碍。贾第鞭毛虫病毒（GLV）是一种特异性感染G. duodenalis的原生动物病毒，其特征为无分段、无包膜的双链RNA结构，并包含RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白（GLVCP）等必需蛋白。尽管RdRp与宿主蛋白的相互作用已被广泛研究，但GLVCP的功能仍 largely unexplored。本研究采用多种方法，包括质谱、共免疫沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC），来鉴定和表征GLVCP与G. duodenalis宿主蛋白之间的相互作用。此外，我们使用CRISPR/dCas9基因编辑和蛋白过表达技术验证了这些相互作用。我们的研究揭示了一个未表征蛋白（UCP），其包含一个糖基转移酶稳定（Gtf2）结构域，与GLVCP相互作用。在GLV的影响下，UCP调节GlcNAc介导的O-糖基化，并调控涉及不同通路的多种蛋白，如ABC转运蛋白、苹果酸脱氢酶（MDH）和组织蛋白酶B（CTSB），从而为病毒生存创造有利的细胞内环境。我们的发现为GLV生命周期提供了关键见解，并强调了寄生虫与病毒之间复杂的相互作用。这些结果可能为控制贾第虫感染及其相关疾病的新策略提供信息。

IMPORTANCE

我们的研究阐明了GLV与G. duodenalis之间的新型调控机制，突出了涉及GLVCP和一种宿主蛋白（UCP，一种包含Gtf2结构域的特征化蛋白）的复杂相互作用。这种相互作用增强了宿主GlcNAc介导的O-糖基化，抑制了ATP转运，并促进了组织蛋白酶B对GLVCP的切割，从而促进了病毒基因组的脱壳和释放。这些发现加深了我们对GLV生命周期的理解，并填补了我们对原生动物病毒与其宿主之间复杂动态的知识空白，为开发控制贾第虫感染的创新策略提供了宝贵见解。

INTRODUCTION

贾第虫是一种单细胞、有鞭毛、双核的肠道原生动物，能够感染几乎所有脊椎动物。它是导致腹泻的主要病原体之一，尤其影响儿童和旅行者。在大多数人类病例中，贾第虫感染保持无症状和潜伏状态，经常未被察觉。感染始于人类或牲畜摄入被传染性包囊污染的水或食物。摄入后，这些包囊在消化道中遇到胃酸和胆汁，触发其转化为近端小肠中的滋养体。滋养体随后使用专门的腹吸盘定植于肠壁。成功定植后，滋养体迅速增殖，破坏小肠中的正常营养吸收，导致腹泻和腹痛等症状。在儿童病例中，贾第虫感染可能导致严重的营养不良和认知发育问题，严重情况可能最终导致慢性并发症，如认知衰退和生长迟缓。分子分析将贾第虫分为八个不同的组合（组合A–H），其中组合A和B被认为为人畜共患，强调了该寄生虫感染人类和动物的能力。

贾第虫拥有一个简化的基因组，使其成为探索生命起源和基因调控机制的重要模式生物。研究贾第虫与其宿主之间以及病毒与贾第虫之间的复杂相互作用，为寄生机制和进化动力学提供了宝贵见解。特异性感染寄生原生动物的病毒被称为寄生原生动物病毒（PPVs）。近年来，在各种寄生原生动物中检测到了病毒样颗粒（VLPs），如溶组织内阿米巴、Leishmania hertigi、隐孢子虫和阴道毛滴虫。这些病毒实体具有几个 distinct 特征：它们是无包膜和无分段的，具有二十面体形态。它们的基因组大小范围约为4至7 kb，直径范围为30–40 nm。此外，这些病毒能够编码至少两种蛋白，即CP和RdRp。最初，原生动物病毒被分类为单链RNA病毒家族。然而，在发现其他病毒后，这一分类受到了质疑。例如，具有负义单链RNA（ssRNA）基因组的溶组织内阿米巴病毒已被重新分类为弹状病毒科，而含有双链DNA（dsDNA）的Acanthamoeba polyphaga mimivirus（APMV）仍未分类。

对PPVs对寄生虫本身以及宿主-寄生虫相互作用的影响的调查揭示了多种机制。一方面，PPVs可以调节寄生虫的生物学特性，影响其增殖率和代谢途径，如糖异生和脂质代谢。另一方面，PPVs也可以改变寄生虫与宿主之间的相互作用，从而改变感染模式和致病机制。此外，PPVs可能损害或延迟宿主免疫系统识别和消除寄生虫的能力， effectively serving as an “ally” to the parasite。另外，PPVs可以利用寄生虫作为保护性载体，保护自己免受不利环境条件的影响。这些发现表明PPVs可能在寄生虫的生存策略中扮演关键角色。

GLV是一种专门感染G. duodenalis的寄生原生动物病毒。1990年，国际病毒分类委员会（ICTV）正式将其分类为原生动物病毒。GLV在分类学上位于Riboviria realm、Orthornavirae subrealm、Duplornaviricota phylum、Chrymoviricetes class、Ghabrivirales order、Totiviridae family和Giardiavirus genus。作为Totiviridae家族的成员，GLV被 characterize 为一种无分段、无包膜的dsRNA病毒。它拥有一个线性、末端开放的dsRNA基因组，约6.3 kb，一个约100 kDa的衣壳蛋白和一个约190 kDa的RdRp。RdRp在dsRNA病毒中至关重要， facilitating viral genome replication, transcription, and RNA recombination。我们实验室先前的研究表明，RdRp分别与伴侣蛋白DnaJ（GL50803_0017483）和Rab2a（GL50803_0015567）相互作用。抑制这些蛋白的转录导致GLV拷贝数显著减少。观察到的减少不能 solely attributed to the proliferation of Giardia trophozoites，表明DnaJ和Rab2a（未发表数据）在GLV中扮演正调控角色。然而，这种调控发生的 exact mechanisms 尚未 fully elucidated。此外，作为GLV的关键蛋白，RdRp需要多个贾第虫蛋白的协调参与以执行其生物学功能。初步调查中确定的许多RdRp的潜在相互作用伙伴仍有待彻底探索。

与广泛研究的GLV的RdRp相比，GLVCP largely neglected。这种 oversight 部分归因于GLV表面缺乏病毒包膜和 spikes，这些特征通常与其他dsRNA病毒中的病毒进入和复制相关。GLV通过非 caveolin 介导的内吞作用进入贾第虫，没有明确的宿主蛋白被确定参与此过程。因此，关于GLVCP是否参与GLV复制并影响其生命周期，以及贾第虫中宿主蛋白与GLVCP在调控病毒增殖中的相互作用的研究仍然有限。

基因编辑技术的最新进展，特别是CRISPR/Cas系统，为研究人员提供了研究贾第虫中蛋白功能的强大工具。例如，CRISPR/Cas9已被用于敲除编码蛋白如髓样白血病因子（MLF）和DNA拓扑异构酶IIIβ的基因，从而揭示它们在贾第虫包囊形成中的作用。尽管CRISPR/Cas技术有潜力，但它们在阐明GLV与贾第虫之间相互作用的应用仍未充分探索。本研究旨在利用质谱、Co-IP和BiFC等方法鉴定和表征GLVCP与宿主蛋白之间的相互作用。我们采用CRISPR/dCas9基因编辑和蛋白过表达技术来验证这些相互作用蛋白的功能，并研究它们在GLV感染和复制中的作用。通过筛选潜在的相互作用蛋白，我们鉴定了一个能够与GLVCP相互作用的未表征蛋白，该蛋白包含一个与Gtf2蛋白功能相关的结构域。在GLV的影响下，该蛋白能够调节贾第虫滋养体中的O-糖基化，介导ATP转运，并促进GLVCP切割和病毒基因组释放，从而为GLV生存创造有利的细胞内环境。预计本研究将为GLV生命周期提供关键见解，并增强我们对寄生虫-病毒相互作用的理解。

MATERIALS AND METHODS

G. duodenalis cultivation

无GLV的G. duodenalis分离株（组合A，WB strain，ATCC No. 30957）和含GLV的G. duodenalis分离株（指定为VG strain，组合A1，保存于吉林大学兽医学院寄生虫学实验室）在37°C下无菌培养。培养物在修改的TYI-S-33培养基中生长，pH调整为7.1，并补充12.5%胎牛血清（Every Green，浙江）和1 mg/mL牛胆汁（Sigma-Aldrich，USA），直至达到对数生长期。

GLV isolation and construction of GLV-infected Giardia

GLV颗粒从VG strain滋养体培养基中分离，使用参考文献28中描述的方法。简要来说，收集培养基，通过离心在2,000 × g下10分钟去除未附着的滋养体和碎片。产物经过冻融循环、研磨和通过0.22 μm过滤器过滤。然后在4°C下以15,000 × g离心30分钟。病毒沉淀在4°C下以100,000 × g超离心2小时。将病毒重悬于冷PBS中，并加入氯化铯（A620054，Sangon Biotech，China）以达到1.39 g/mL的密度。在160,000 × g下进行密度梯度离心16小时。通过核酸电泳鉴定病毒阳性部分，在20%无菌PBS/甘油中透析，调整为50%甘油，过滤灭菌，并储存于?80°C。

完整GLV dsRNA的浓度根据先前研究定量，6 ng病毒RNA对应于1 × 10⁹ virions。无GLV的贾第虫WB strain接种每滋养体1,000个病毒颗粒。传输稳定性评估超过50代。滋养体在80%–90%汇合时进行传代培养。收集第1、2、5、10、30和50代的样本，以及无GLV和含GLV的对照。使用琼脂糖凝胶电泳检测GLV基因组，并进行RNA和蛋白提取以评估GLV转录和表达水平。

Reagents, plasmids, and antibodies

G418 sulfate和Puromycin Dihydrochloride购自YEASEN（Shanghai，China）。抗HA磁珠购自MCE（Shanghai，China）。pGEM-7zf (+)载体由上海泽业生物科技有限公司合成。pcDNA3.1-N-3HA载体、pcDNA3.1-N-FLAG载体、pBiFC-bFosVC155载体、pBiFC-bJunVN173载体、pBiFC-VC155载体和pBiFC-VN173载体来源于我们实验室的收藏。本研究中使用的抗体包括抗GLVCP血清（1:2,000用于WB）、抗UCP血清（1:2,000用于WB）、抗CTSB血清和抗Gl tubulin血清（1:1,000用于WB），所有这些均按照本文描述的多克隆抗体制备方法制备并储存于我们实验室。此外，O-linked N-Acetylglucosamine Recombinant Rabbit mAb (S-R256)（兔mAb，1:500用于WB，S0B0373，STARTER）、抗HA Tag Recombinant Antibody（兔mAb，1:5,000用于WB，81290-1-RR，Proteintech）、抗FLAG Tag antibody（兔mAb，1:2,000用于WB，GB15939，Servicebio）和multi-rAb Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H + L)（RGAR0001，1:5,000用于WB，Proteintech）从各自制造商处获得。

Plasmid construction

Target gene overexpression

通过从G. duodenalis基因组DNA PCR扩增编码序列来实现目标基因的过表达，引物详见表S1。pGL-3HA-Neo载体通过将3 HA和Neo cassette插入BamHI线性化的pGEM-7zf (+)载体中，通过Gibson组装来设计。类似地，通过将γ-giardin启动子和目标基因连接到pGL-3HA-Neo载体 via Gibson组装来构建相对过表达载体。

Guide RNA design and cloning

使用EuPaGDT设计工具（http://grna.ctegd.uga.edu/）为CRISPR干扰（CRISPRi）系统设计指导RNA（约20个核苷酸）， specifically targeting the NGG protospacer adjacent motif (PAM) sequence。针对G. intestinalis组合A GiardiaDB-28基因组评估潜在的脱靶效应。指导RNA寡核苷酸，列于表S2，包含与载体序列互补的四个碱基突出端，并通过加热至95°C 5分钟然后以每分钟5°C的速率逐渐冷却至室温（RT）来退火。使用Quick Ligase（M2200S，NEB），随后将粘性末端片段克隆到BbsI消化的dCas9g1pac载体中，该载体由美国加州大学戴维斯分校的Scott Dawson教授 kindly provided。

Parasite transfection

贾第虫滋养体的转染如下：总共10⁷个细胞重悬并与纯化的环状载体结合，随后在冰上孵育10分钟。然后，细胞在4 mm cuvette中使用Bio-Rad Gene Pulser X cell进行电穿孔，设置电压为375 V，电容为1,000 μF，电阻为750 Ω。电穿孔后，细胞在冰上额外孵育10分钟后转移到12 mL培养基中。在无药物情况下孵育一段时间后，将嘌呤霉素或G418以最终浓度15 μg/mL引入培养管中。每2天更换为新鲜含药培养基。最终，贾第虫滋养体在嘌呤霉素或G418的抗生素选择下维持用于后续实验程序。

RNA extraction and quantitative real-time PCR

从新鲜培养的贾第虫滋养体中提取总RNA，使用TransZol试剂（TransGen Biotech，Beijing）按照制造商协议进行，并随后重悬于经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中。使用Nanodrop 2000分光光度计评估RNA纯度，以260/280 nm吸光度比作为评估标准。取2 μg RNA等分试样使用All-In-One 5X RT MasterMix试剂（abm，Richmond，BC，V6V 2J5，Canada）反转录为互补DNA（cDNA）。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（YEASEN，China）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。qRT-PCR条件如下：初始预孵育在95°C下5分钟，随后40个循环的95°C 10秒和60°C 30秒。用于qRT-PCR的正向和反向引物序列在表S3中提供。G. duodenalis 18S核糖体RNA基因（18S rRNA）和肌动蛋白基因的转录本被用作参考基因以标准化样本中的mRNA水平。所有实验均使用三个独立制备的生物学重复进行。

Western blot

收集细胞并重悬于细胞裂解缓冲液（Beyotime，China）中，该缓冲液含有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Beyotime，China），用于后续Western blot和免疫沉淀分析。从各种贾第虫滋养体和细胞系提取的蛋白质，包括具有 knockdown 或过表达质粒的滋养体以及含有BiFC或真核表达质粒的HEK293T细胞，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）解析，并随后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，Bedford，MA，USA）上。膜在含有5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水（TBS）中在RT下封闭2小时，随后在4°C下与适当的一抗在补充有0.05% Tween 20（TBST）的TBS中 overnight incubation。此后，膜用辣根过氧化物酶偶联的二抗处理，并使用增强化学发光系统（Vigorous，Beijing，China）检测免疫反应性蛋白。扫描胶片上蛋白条带的强度使用Image J软件（NIH image software）分析相对灰度强度，以贾第鞭毛虫微管蛋白作为加载对照。

Protein-protein interaction assay

Co-IP

HEK293T细胞在6孔板中培养，并使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）转染pcDNA3.1-N-3HA-GLVCP、pcDNA3.1-N-FLAG-UCP或pcDNA3.1-N-FLAG-UCP的截断片段。在转染后24小时收获全细胞裂解物（input），并在12,000 rpm下离心5分钟。裂解物与HA标签磁珠以1:50的比例 overnight incubation。随后，蛋白结合珠用TBST洗涤四次，每次10分钟。洗涤步骤后，蛋白结合珠通过8% SDS-PAGE分析并转移到PVDF膜上。膜随后用5%脱脂牛奶在TBS中封闭，并与特定一抗在4°C下 overnight incubation。用TBST洗涤后，膜用羊抗兔IgG二抗处理。最后，使用化学发光方法检测特定蛋白条带。

BiFC

为进行BiFC实验，我们设计引物以促进BiFC实验质粒与GLVCP和UCP respectively 的连接。质粒pBiFC-bFosVC155和pBiFC-bJunVN173被用作阳性对照。使用Gibson组装，这些质粒中的Fos和Jun基因被替换为GLVCP和UCP基因以建立实验组。同时，质粒pBiFC-VC155和pBiFC-VN173作为阴性对照。HEK293T细胞在6孔细胞培养板中的载玻片上接种，并随后使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）进行转染。孵育24小时后，使用荧光显微镜进行检测。

Protein interaction prediction by AlphaFold 3

使用先进的AlphaFold 3算法准确预测了GLVCP和UCP的三维晶体结构模型。此外，通过AlphaFold 3精确确定了GLVCP与UCP相互作用形成的复合结构，并随后使用Schr?dinger软件套件进行了全面分析。

Transcriptome-metabolome correlation analysis

从培养基中收集形态完整的贾第虫VIG和WB strain滋养体（各约5 × 10⁷）。加入预冷PBS，轻轻搅拌1分钟以促进洗涤。弃去PBS，并重复此洗涤步骤两次以确保完全去除培养基。随后将滋养体进行冰浴30分钟，并在2,000 g下离心10分钟。

对于转录组分析，将沉淀重悬于TransZol中，沉淀，并储存于?80°C。这些样本随后送往上海生物剖面技术有限公司进行文库构建和使用Illumina HiSeq平台的下一代测序。

对于代谢组学样本的制备，将沉淀重悬于最小体积的预冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在液氮中快速冷冻1分钟，并随后储存于?80°C。这些样本随后被送往上海生物剖面技术有限公司进行超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析。

Electron microscopy

扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的详细程序在补充材料中提供。

Statistical analysis and image generation

数据表示为来自三个独立样本的平均值±标准误差。使用学生t检验（配对或非配对）或单因素或双因素方差分析（ANOVA）评估统计显著性，随后使用Dunnett's事后检验进行多重比较。显著性水平表示为P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.0001，ns表示不显著（P > 0.05）。图使用Adobe Illustrator 2024组合，而示意图使用HOME for Researchers平台内的Figdraw 2.0创建。

RESULTS

GLV can enhance Giardia proliferation

作为dsRNA病毒家族的成员，GLV的生命周期需要各种宿主蛋白的参与。为了鉴定通过GLVCP促进GLV生命周期的贾第虫蛋白，我们从贾第虫VG strain中分离和纯化了GLV。这种纯化的GLV用于自然感染WB strain，随后指定为VIG strain（病毒感染的贾第虫）。总RNA的琼脂糖凝胶电泳显示，VG strain中有一个 distinct band 对应于病毒dsRNA，而在WB strain中 absent，确认了GLV在VG strain中的存在。从VG strain通过密度梯度离心纯化的GLV颗粒用磷钨酸染色，允许通过透射电子显微镜观察其形态。颗粒 exhibited an approximately diameter of 38 nm。

为了评估我们 engineered GLV感染的贾第虫的生长稳定性，我们收集了VIG strain在第1、2、5、10、30和50代（指定为VIG1、VIG2、VIG5、VIG10、VIG20、VIG30和VIG50）的滋养体，以及来自WB strain和VG strain的滋养体，用于蛋白和总RNA分析。琼脂糖凝胶电泳 confirmed the persistent presence of the GLV genome across successive generations of the VIG strain。GLV衣壳蛋白的转录和表达水平在传输过程中 exhibited fluctuations。值得注意的是，随着代数的增加，VIG strain中GLV的转录和翻译水平逐渐与VG strain中观察到的对齐， indicating an increasingly stable relationship between GLV and Giardia。

为了确定GLV对贾第虫滋养体增殖的影响，我们进行了一项为期7天的观察性研究。 findings indicated that the proliferation rate of GLV-infected Giardia (VG and VIG strains) exceeded that of WB strain。扫描电子显微镜（SEM） demonstrated that the morphology of the VIG strain trophozoites remained predominantly unchanged。这些观察表明GLV感染的贾第虫可以稳定地传输给后代。此外，虽然GLV增强了贾第虫的增殖，但它不影响其形态特征。基于这些结果，我们使用稳定携带GLV的VIG strain（指定为VIG50）进行后续研究。

Multiple functional proteins are involved in GLV replication

GLV有能力调节G. duodenalis的增殖；然而，关于GLV利用贾第虫蛋白调节自身生命周期的机制研究有限。GLVCP被确定为与贾第虫蛋白相互作用的初始组件。因此，我们开发了一个原核GLVCP表达载体，纯化了衣壳蛋白，并生成了多克隆抗体。这些多克隆抗体特异性检测VIG strain中的GLV。随后，我们使用抗GLVCP多克隆抗体和兔源性IgG对VIG strain的滋养体蛋白进行免疫沉淀，通过LC-MS/MS分析鉴定出352个与GLVCP相互作用的候选蛋白。为确保鉴定的相互作用蛋白的可靠性，我们从贾第虫中提取了膜和细胞质蛋白，也通过LC-MS/MS分析筛选了1,018个细胞质蛋白和563个膜蛋白。

结合这些蛋白的基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，从352个GLVCP的候选相互作用中鉴定出48个可能参与病毒生命周期过程的蛋白，如内吞作用、吸附和蛋白合成。这些48个蛋白在VIG和WB strain中的mRNA水平的qRT-PCR分析 revealed that ten proteins, including cathepsin B (CTSB_14019), trophozoite antigen GTA-2 (GTA2_15427), ubiquitin family protein (UBL_23300), v-ATP synthase subunit B (ATP6V1B_12216), vps24 (VPS24_7323), vps26 (VPS26_100864), and four uncharacterized proteins (UCP_87577, UCP_94463, UCP_7188, and UCP_3582), exhibited significant alterations in transcript levels in response to GLV。这些发现表明这些蛋白 likely involved in GLV replication within Giardia trophozoites。

The novel UCP interacts with GLVCP

基于上述结果，很明显GLV感染影响某些贾第虫蛋白的转录水平，包括CTSB_14019、UCP_87577、GTA2_15427、UBL_23300、UCP_94463、UCP_7188、ATP6V1B_12216、VPS24_7323、VPS26_100864和UCP_3582。这些蛋白可能 directly regulated by GLVCP。为了确定是否有滋养体蛋白直接与GLVCP相互作用，我们为这10个蛋白 engineered recombinant eukaryotic expression vectors，并使用Co-IP验证了它们与GLVCP的相互作用。Western blot分析 revealed that an uncharacterized protein (GL50803_0094463, NCBI ID: XP_001708344.1), referred to as UCP, exhibited a direct interaction with GLVCP as demonstrated by Co-IP， corroborating the findings from the BiFC experiments。此外，GLVCP和UCP结构的三维结构分析和相互作用位点建模 indicated a stable binding domain between UCP (depicted in yellow) and GLVCP (depicted in blue)。值得注意的是，观察到UCP的氨基酸Asn93与GLVCP的氨基酸Ser544之间、UCP的氨基酸Arg156与GLVCP的氨基酸Phe155之间、以及UCP的氨基酸Val192与GLVCP的氨基酸Asn487之间存在氢键。这些相互作用提供了UCP与GLVCP之间关系的额外确认。AlphaFold 3预测的UCP与GLVCP之间10个最显著的相互作用位点详见表S6。

为了阐明促进UCP与GLVCP结合的主要结构域，我们使用InterPro对UCP氨基酸序列进行了结构预测分析。该分析 revealed that UCP possesses an N-terminal tyrosine-phosphorylation site, three SCOP domains (SCOP1, SCOP2, and SCOP3), and a C-terminal characterized by low complexity。在这些预测的结构域指导下，我们使用Gibson组装构建了UCP的截断片段。值得注意的是，蛋白表达 assays indicated that truncation of the initial 69 amino acids at the N-terminal end of UCP resulted in a lack of protein expression， suggesting that this segment is crucial for UCP expression。相反，包含氨基酸76–119、271–379或379–480的截断并未阻碍与GLVCP的相互作用。然而，BiFC实验 demonstrated that only the UCP variant retaining the first 378 amino acids was capable of interacting with GLVCP within 293T cells。WB结果表明，包含前378个氨基酸的UCP截断变体与GLVCP的相互作用 notably stronger compared to other variants，与蛋白-蛋白相互作用建模 findings aligning。这些结果表明UCP directly interacts with GLVCP，其中前378个氨基酸对此相互作用至关重要。

The novel UCP regulates the replication of GLV in G. duodenalis

蛋白-蛋白相互作用 assays confirmed UCP’s direct interaction with GLVCP， implying its potential role in the GLV’s life cycle。为了研究UCP对GLV复制的影响，我们开发了UCP过表达和 knockdown strains。过表达质粒通过将UCP基因插入骨架质粒的MCS区域创建，使用Gibson组装与γ-giardin启动子、5′-UTR和3′-UTR组装。对于 knockdown，gRNA被退火并连接到BbsI消化的dCas9g1pac质粒上，形成UCP knockdown质粒。为了优化