基于超分子化学介导Cas12a催化聚集的假体关节感染诊断新策略

本文推荐一种基于超分子化学介导Cas12a催化聚集（CCA）的新型检测策略，用于实现无需预扩增的细菌超灵敏检测（检测限低至1 CFU/mL）。该策略通过设计多功能CCA探针，结合宿主-客体相互作用抑制Cas12a的顺式切割（cis-cleavage），并在细菌周围形成催化聚集体，显著提高反式切割（trans-cleavage）效率（kcat/Km达5.1×109 s-1M-1）。该方法具备高灵敏度、通用性与稳定性，为假体关节感染（PJI）的快速诊断提供了新途径。

　　

Reagents and chemicals

本研究使用的所有DNA寡核苷酸均由上海生工生物科技有限公司定制合成并经HPLC纯化，序列详见表S1。EnGen? LbaCas12a (Cpf1) 酶（产品编号 M0653T）购自北京NEB公司。其他试剂包括二甲基亚砜（DMSO）、40%乙二醛溶液、乙二胺四乙酸（EDTA）、1-氮杂金刚烷（AA）和氯化汞（HgCl₂）均购自标准供应商。

Synthesis and characterization of CCA probe

CCA探针通过多步合成路线高效制备，包括：（1）通过铜(I)介导的点击化学反应将1-氮杂金刚烷（AA）与炔基修饰的DNA连接；（2）主机-客体复合物形成；（3）乙二醛处理；（4）硼酸酯形成（图1a和1b）。DNA-AA复合物最初通过AA与炔基修饰DNA的点击化学反应合成（图1a）。红外光谱分析（图1c）显示炔基特征峰消失，表明反应成功完成。随后通过主机-客体相互作用将葫芦[6]脲（CB[6]）装载到AA修饰的探针上，形成空间屏障保护探针免受Cas12a的顺式切割。经乙二醛处理后，探针5'端的碱基与乙二醛形成稳定的二羟基加合物，其1,2-顺式二醇与1,4-苯二硼酸（PDBA）的硼酸基团可逆结合形成环状酯键，从而使探针具备广谱细菌结合能力。

Conclusion

假体关节感染是关节置换术后最具破坏性的并发症之一，可导致关节疼痛、住院时间延长、反复手术、功能障碍甚至死亡。诊断或治疗不足将导致惊人的发病率和死亡率。当前亟需能够检测痕量细菌的快速、灵敏且可靠的诊断方法。病原体培养和qPCR虽是当前细菌检测的金标准，但其操作繁琐、耗时长且存在假阳性/假阴性风险。本研究提出的CCA策略通过超分子化学介导的Cas12a催化聚集实现了无需扩增的超灵敏细菌检测，为PJI的临床诊断提供了创新性解决方案。