综述：通过性别重编程实现蚊媒控制：白纹伊蚊雄性相关转基因

这篇前瞻性综述系统探讨了基于Nix基因的遗传控制策略，为白纹伊蚊防控提供了全新范式。文章详述了如何利用雄性决定因子（M-factor）构建转基因性别品系（GSS），结合CRISPR技术开发归巢内切酶驱动（HEG）、减数分裂驱动（meiotic drive）和Y连锁编辑器（YLE）等前沿技术，为替代传统杀虫剂防控提供了高效、物种特异性的解决方案。

　　

引言

全球正面临白纹伊蚊（Aedes albopictus）等病媒昆虫扩散的严峻挑战。这种被称为"亚洲虎蚊"的入侵物种通过全球贸易路线和气候变暖，已广泛分布于热带和温带地区。与埃及伊蚊（Aedes aegypti）相似，白纹伊蚊能够传播基孔肯雅热、登革热、寨卡和黄热病等虫媒病毒，以及犬心丝虫（Dirofilaria immitis）等寄生虫。其快速的分布区扩张、嗜人血特性、对病毒的易感性和白天 aggressive 的叮咬活动，使其成为导致登革热爆发和基孔肯雅热流行的强有力病媒。

传统化学防治方法受到杀虫剂抗性等位基因快速传播的限制，加之对农药使用的严格监管，迫切需要更有效且环境友好的替代方案。遗传控制作为一种生物防治形式，以物种特异性、自我扩散的方式靶向害虫的繁殖能力。

遗传控制技术演进

遗传控制的原型是昆虫不育技术（SIT），自1955年以来已成功抑制了新大陆螺旋蝇（Cochliomyia hominivorax）和几种实蝇科害虫。SIT依赖于释放携带大量辐照诱导突变的不育雄性，这些雄性与野生雌性交配后使其后代无法存活。针对蚊子的区域性SIT田间试验已取得初步成功，并发展出多种新技术。

"增效"SIT（boosted SIT）释放的不育雄性能够用杀幼虫剂污染野生雌性和幼虫孳生地；不相容昆虫技术（IIT）则利用沃尔巴克氏体（Wolbachia）通过细胞质不相容性使受感染蚊子不育。IIT作为独立技术或与SIT结合，已在新加坡、墨西哥、泰国和澳大利亚针对埃及伊蚊部署，并在中国针对白纹伊蚊实施，取得令人鼓舞的成果。

蚊子基因工程进展产生了更多类似SIT的群体控制策略。RIDL（携带显性致死基因的昆虫释放）是第一种基于转基因蚊子释放的控制方法，这些蚊子表达四环素抑制性显性致死转基因。在缺乏四环素的情况下，表达致死效应器的幼虫死亡。大规模生产的埃及伊蚊RIDL雄性在开曼群岛、巴拿马和巴西释放，与野生雌性交配导致其后代死亡，有效抑制了当地蚊子种群。

更近期的雌性特异性版本（fsRIDL）将性别特异性剪接的doublesex内含子纳入致死基因中。释放的fsRIDL纯合雄性雄性的田间女儿在发育过程中死亡，而儿子保持存活并将雌性致死性传播给一半后代。这种形式的fsRIDL已在巴西和美国针对埃及伊蚊部署。早期的fsRIDL系统利用飞行肌Actin4启动子驱动毒性转基因表达，已为白纹伊蚊和斯氏按蚊（An. stephensi）开发。

Nix基因的革命性发现

研究人员专注于绘制昆虫性别决定通路的上游基因，以捕获其初级触发器称为M因子。在伊蚊中，M因子Nix位于常染色体1的雄性特异性区域，称为M基因座。尽管位于常染色体上，M基因座的行为类似于微型Y染色体：雄性有益和/或雌性拮抗序列（如埃及伊蚊中雄性飞行所需的myo-sex基因）在携带Nix的M基因座内积累，并且选择更紧密的连锁有利于结构重排，逐渐抑制与同源m基因座的重组。

在M基因座外转基因表达Nix可将遗传雌性转化为表型雄性，称为伪雄。在埃及伊蚊中，伪雄可育但飞行能力受损；而在白纹伊蚊中，由于myo-sex很可能不与M连锁，伪雄既具有飞行能力又可育。这些新型的合成性别决定遗传基因座让人想起家蝇（Musca domestica）中的自然情况，其中雄性因子可变地存在于Y、X或任何常染色体上。这种可塑性为伊蚊的下一代遗传控制提供了有希望且多功能的基础，将雄性化与可选择标记和其他效应器结合在单个可遗传构建体中。

遗传性别品系

有效的抑制策略，无论是经典SIT、IIT还是基于转基因的方法，都依赖于只释放雄性。即使释放种群中存在少量雌性，也会增加流行病学风险，使公众接受复杂化，并通过在目标野生种群中播散沃尔巴克氏体感染而破坏IIT策略。

传统的蚊子分性别方法依赖于利用雄性和雌性蛹之间的自然大小二态性进行人工或机械手段，但这些方法劳动密集型、容易出错，通常只能回收50%的雄性，且污染0.1-1%的雌性。遗传性别品系（GSS）通过将可选择性状与性别联系起来开发，以便以更高通量的方式识别和消除雌性。

最早的蚊子GSS是利用辐照诱导的染色体易位将杀虫剂抗性或眼色与雄性决定基因座联系起来开发的。这些品系证明GSS可用于蚊子大规模饲养，但几个问题限制了其可扩展性和采用，包括雄性适应度降低、标记不稳定性以及操作限制，如释放雄性中残留杀虫剂或在昆虫发育后期进行性别分选。

更近期的转基因性别品系使用显性致死（如上述fsRIDL）或可选择性状（如荧光标记）提供更大的稳定性和更少的繁殖力损失。这些品系消除了随机诱变、染色体重排和化学选择，并且标记与性别之间的工程连锁预计比经典GSS稳定得多。

在白纹伊蚊伪雄品系中，荧光标记与Nix转基因紧密耦合，而雌性是野生型。这些品系可以 readily 作为GSS，在早期幼虫阶段使用荧光流式细胞术进行性别分离，好处是在卵孵化后立即消除雌性幼虫，减少浪费并使雄性大规模生产能力翻倍。

由于转基因Nix和荧光标记在同一构建体上，预计重组不会打破雄性化和荧光性状。这一优势与最近开发的基于荧光标记性别特异性内含子剪接的埃及伊蚊GSS品系SEPARATOR共享。另外的埃及伊蚊和白纹伊蚊GSS，其中荧光与内源性Nix遗传连锁，用于量化流式细胞分选的通量。此外，将分选的野生型雌性与携带m连锁荧光标记的GSS雄性杂交：该交叉的所有女儿都是荧光的，所有儿子都是野生型，为大规模生产非转基因雄性提供了机会。

在埃及伊蚊中，最近开发了基于荧光标记和m与M连锁致死突变组合的新型GSS，以生产非转基因雄性，规避遗传交叉的需要，这种方法称为DeMark。

流式细胞术蚊子幼虫分选器的高成本激励开发绕过通过荧光分选消除雌性的GSS。这最近通过将Nix与隐性yellow突变的拯救构建体配对，在纯合yellow突变品系背景下实现。携带转基因的伪雄恢复野生型深色色素沉着，而非转基因雌性保持黄色，使得从第一龄幼虫开始即可进行视觉或基于相机的性别分选。

出乎意料的是，yellow突变产生了两个额外好处：(i) 黄色雌性与拯救雄性相比发育缓慢，导致夸张的雄先成熟现象，便于性别分离；(ii) yellow雌性产卵的干燥抗性丧失，降低了可能意外释放到田间的雌性的繁殖力。这种雄性化并拯救的逻辑现在可以应用于适合大规模选择的性状，例如温度敏感致死（tsl）等位基因的性别特异性拯救，复制了经典地中海果蝇Vienna-8 GSS的高通量性别分离。

总之，GSS已从脆弱的辐射突变体发展为精确的单基因开关：Nix转基因提供即插即用的性别分离模块，现在可以与多种遗传控制平台耦合。

与CRISPR基遗传控制的协同作用

除了性别分选应用外，Nix从单个转基因盒赋予雄性化的能力为CRISPR基遗传控制提供了新的设计可能性，包括基于归巢的基因驱动、减数分裂驱动和靶向雌性基因的雄性特异性编辑器。在此类设计中，含有Nix的CRISPR转基因可以通过使总体性别比例偏向雄性，通过降低雌性适应度和繁殖力，同时将转基因与它们在雌性中引起的负选择隔离，或两者兼而有之来抑制蚊子种群。

与性别决定更复杂的物种不同，将CRISPR组件嵌入含Nix的转基因中规避了需要精确了解m/M基因座的需求，这些基因座由于其重复性仍然特征不清。

归巢内切酶基因（HEG）驱动是最广泛探索的工程基因驱动类型，设计通过在杂合子种系中将自己复制到野生型染色体中传播，这一过程称为归巢。归巢促进其超孟德尔传递，允许HEG在种群中快速传播，即使它与适应度成本相关。

对于群体抑制，工程化HEG通常插入隐性雌性特异性繁殖力或生存力基因内，从而破坏它们。随着HEG随时间在种群中传播，可育或存活的雌性变得罕见，直到种群最终崩溃。将Nix转基因与工程化HEG关联可以改变这种范式：HEG可以在杂合伪雄种系中复制（归巢）Nix，从而使后代性别比例偏向伪雄。

从任何常染色体位置独立于归巢靶位点的功能，这理论上可以实现。然而，为确保其长期功效，Nix连锁HEG应插入高度保守和功能受限的靶位点内，以避免出现HEG抗性等位基因，这些等位基因在靶序列通过非同源末端连接而非同源重组修复时形成。HEG抗性功能性突变等位基因抑制后续归巢并停止基因驱动的传播。靶向高度受限的靶标将降低形成逃避负选择的功能性突变等位基因的可能性。

此外，由于含Nix的HEG只能在伪雄种系中驱动（凭借Nix雄性化），雌性特异性单倍不足基因可能代表最佳靶标，以便通过NHEJ形成的突变等位基因产生无法存活或不育的女儿。值得注意的是，这不同于经典HEG，后者设计用于在两种性别种系中诱导归巢，这增加了它们的传播。不幸的是，在埃及伊蚊中开发基于归巢的基因驱动的努力迄今通常产生 modest 的归巢率。这些挑战是否同样影响白纹伊蚊归巢驱动尚不清楚，但开发该物种种系活性CRISPR工具箱（适合启动子鉴定和表征以优化Cas9和引导RNA表达）的工作正在进行中。

减数分裂驱动代表一种不依赖归巢的策略，它在配子形成过程中偏向染色体分离以 favor 驱动阳性染色体的传递。有趣的是，自然发生的伊蚊性别扭曲减数分裂驱动是最早被表征的之一，并启发了一些最早的开创性工作，提出侵入性或驱动Y染色体用于蚊子种群控制。

在冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中开发此类工程性别扭曲器取得了显著进展，使用在精子发生过程中靶向X染色体重复序列的内切酶——一种称为X粉碎的实现。转基因雄性主要产生Y bearing 配子，因此，过多的雄性后代。有趣的是，最近在冈比亚按蚊中使用CRISPR内切酶靶向单拷贝X染色体序列的工作也导致性别扭曲。

这些结果表明，X染色体上多个位点的切割对于消除X bearing 配子不是必需的，相反，内切酶在精子发生过程中的活性时间决定了X染色体上的双链DNA断裂是否可以修复并传递给女儿，或者导致配子消除和减数分裂驱动。因此，伊蚊物种的未来工作应探索产生CRISPR基减数分裂驱动的可能性。这些可以放置在携带M基因座的染色体上，并靶向m基因座特异性序列，如果有些可以被识别的话。或者，常染色体位点可以在概念验证设计中使用含Nix的减数分裂驱动靶向其插入位点在驱动阴性同源染色体中进行测试，尽管驱动抗性等位基因可能被快速选择。

归巢和减数分裂基因驱动作为侵入性元件在种群中及时空传播。它们对群体抑制的潜在应用被定义为"自我维持"遗传控制策略，因为它们不需要重复释放来维持群体抑制，不像SIT或其更新变体，后者被定义为"自我限制"策略。

然而重要的是，并非所有"自我限制"策略在施加于群体的遗传负荷方面都相同。fsRIDL至少是SIT的两倍强大（每释放雄性），因为田间出生的儿子是存活的，并且 themselves 在与野生雌性交配时有助于群体抑制。一旦释放，fsRIDL转基因由于其对携带它的个体施加雌性特异性致死性而被反选择，并且没有额外释放，几代后从种群中丢失。由于是常染色体，fsRIDL转基因也仅传递给一半田间出生的儿子，导致其持续稀释。

因此，最近提出将诱导显性女儿致死性的CRISPR基转基因与蚊子Y染色体连锁，这种方法称为Y连锁编辑器（YLEs）。在精子发生过程中表达的YLEs靶向单倍不足基因，这些基因是雌性特异性或X连锁的（因为X染色体专门传递给女儿），导致所有女儿致死或不育。与fsRIDL相比，YLEs显著更强大，通过逃避它们在雌性中具有的负选择效应，同时传递给所有未受影响的儿子。然而，YLEs不是侵入性的，因为YLE雄性仍然产生与野生型雄性相同数量的儿子——即性别扭曲不是像减数分裂驱动那样的合子前。

在白纹伊蚊中，YLEs理论上可以更容易开发，因为含Nix的转基因有效地作为雄性特异性Y染色体。Nix、靶向一个或多个雌性特异性单倍不足基因的引导RNA和在精子中表达的Cas9可以组合在插入任何支持Cas9活性和基于Nix的雄性化的基因组位置的转基因上，不像归巢和减数分裂驱动其基因组中的位置需要具体定义。此外，可以靶向双性单倍不足基因（对雄性和雌性都重要），并在伪雄中使用内切酶抗性、重编码的微型拯救来拯救靶向的单倍不足基因，就像性别特异性切割和拯救一样。鉴于它们在遗传控制方法中的巨大潜在效用，表征白纹伊蚊单倍不足基因，特别是雌性特异性基因，是该领域的优先事项。

伪雄的性能与优化

转基因伪雄用于遗传控制的性能高度取决于它们的交配竞争力。在白纹伊蚊中，伪雄（m/m）在体型、飞行能力或繁殖力方面与真雄（m/M）没有差异。关键性别决定基因的表达水平和性别特异性剪接在伪雄中也得以保留。然而，在笼子实验中，伪雄表现出与野生型（WT）雄性相比降低的交配竞争力。这种障碍不太可能由于与转基因或其标记相关的适应度成本，因为具有额外Nix转基因的转基因真雄（m/M）与WT雄性一样具有竞争力。相反，降低的竞争力可能由于缺少额外M连锁基因座或m连锁基因的纯合性。确实，比较差异表达分析揭示了伪雄中M相关转录本的丢失和一些雌性相关转录本的保留。

未来的研究还应在大型笼子或半田间实验中测试转基因伪雄的性能，以验证理论模型和生态预测，因为高密度小笼子实验可能无法揭示伪雄在田间条件下的真实竞争力。同时，未来增强转基因雄性化的努力应专注于改进转基因Nix盒以包括有益的内源性元件，如埃及伊蚊的myo-sex。此类改进可能对于将伪雄的作用从实验室概念验证扩展到有效的遗传控制群体抑制工具至关重要。