基于壳聚糖气凝胶-水凝胶复合膜的诺如病毒高效现场检测预处理装置研发与应用

本文创新性地开发了一种集成壳聚糖气凝胶与水凝胶复合膜的"两步串联"式微预处理装置（TSMPD），结合RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测系统，实现了海鲜中诺如病毒（NoV GII.4）的高效富集与快速检测。该技术可在80分钟内完成病毒富集（回收率25.35%），2小时内实现现场筛查（检测限97 copies/μL），兼具高特异性与稳定性，为食源性病毒现场检测提供了便携、低成本的解决方案。

　　

Reagents and instruments

所有核苷酸链由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（序列详见表S1）。RPA反应使用的TwistAmp Basic试剂盒购自英国TwistDx公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒（MiniBEST系列）和逆转录试剂（PrimeScript RT with gDNA Eraser）来自北京Takara公司；RNase抑制剂（人胎盘来源）、M-MuLV逆转录酶及Lba Cas12a (Cpf1)蛋白均采购自New England Biolabs公司。

Assembly of pretreatment enrichment devices

本研究设计的TSMPD包含两层功能材料及配套组件。其核心原理是通过精确调控凝胶膜孔径尺寸，在低流速条件下实现颗粒的按尺寸高效分选。

首先，为实现快速简易的样本预处理，我们开发了一种高效病毒富集方案：将壳聚糖气凝胶作为初级过滤层，利用其大孔径高吸附特性快速截留复杂食品基质；随后采用纳米纤维素水凝胶复合膜（小孔径致密结构）进行病毒颗粒的超滤级富集与回收。该装置兼具便携性与现场适用性，为病毒载量定量分析奠定基础。

Conclusion

本研究开发并验证了基于RPA-CRISPR/Cas12a的病毒检测方法，结合水凝胶复合膜与针式过滤器组成的病毒富集系统，构建了从样本处理到结果输出的完整检测流程。通过基于病毒粒径的预处理装置（TSMPD）设计，实现了牡蛎样本中NoV GII.4的高效富集，富集时间缩短至80分钟，回收率达25.35%。结合RPA-CRISPR/Cas12a系统，建立了灵敏度高、特异性强的现场检测方案，检测限为97 copies/μL，为复杂食品样本中病毒的快速筛查提供了创新性技术支撑。