CRISPR/Cas9联合λ-Red重组系统诱导杀鱼爱德华氏菌转座子IS1的异常转座及其机制研究

本研究首次发现CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9）与λ-Red重组系统联合编辑杀鱼爱德华氏菌时，会引发插入序列1（IS1）的特异性转座，破坏I型限制修饰系统M亚基基因。这一现象揭示了基因组编辑工具与移动遗传元件之间存在新型相互作用，对细菌疫苗开发和安全评估具有重要警示意义。

　　

Highlight

细菌菌株

杀鱼爱德华氏菌NH1分离自濒死牙鲆，在含1.5%氯化钠的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中27°C培养。为培养丙氨酸消旋酶基因敲除菌株（E. piscicida Δalr325 NH1 和 E. piscicida Δalr50 NH1），需在培养基中添加终浓度100μg/ml的D-丙氨酸。

通过CRISPR/Cas9技术构建溶血素(ethA)基因敲除株

为构建ethA基因敲除载体，设计了靶向ethA基因的sgRNA（向导RNA）。通过重叠延伸PCR合成同源臂，并与经BsaI酶切的pCas质粒连接。最终构建的pCas-sgRNA-ethA质粒通过电转化导入表达λ-Red重组系统蛋白的E. piscicida NH1感受态细胞中。

杀鱼爱德华氏菌ΔethA NH1的构建

本研究选择对细菌生长无影响的溶血素编码基因ethA进行敲除，成功实现500bp片段缺失（图1A）。经测序验证后，通过温敏性质粒消除获得无质粒的基因编辑菌株E. piscicida ΔethA NH1。

全基因组测序与比较分析

使用Illumina NovaSeq 6000平台对野生型NH1及三个突变株（Δalr325、Δalr50、ΔethA）进行测序。通过BWA工具将测序读数与参考基因组比对，使用SAMtools检测变异，并用SnpEff软件注释变异效应。特别关注了插入序列（IS）的转座情况。

IS1转座的验证

通过PCR和Sanger测序验证IS1转座事件。针对IS1插入区域设计特异性引物，扩增后通过测序确认IS1的插入位置和方向。同时使用定量PCR（qPCR）检测IS1拷贝数变化。

结果

IS1转座至限制修饰系统基因

全基因组比较分析发现，所有CRISPR/Cas9编辑的突变株（Δalr325、Δalr50、ΔethA）均在I型限制修饰系统亚基M基因（hsdM）中发生IS1插入，导致该基因功能丧失。值得注意的是，传统质粒同源重组方法构建的突变株未出现此现象。

IS1转座与CRISPR/Cas9系统的关联

实验证明IS1转座依赖于CRISPR/Cas9介导的双链DNA断裂（DSBs），而与λ-Red重组系统无关。通过对比不同编辑方法发现，只有引入DSBs的CRISPR/Cas9系统会触发IS1转座。

IS1拷贝数分析

qPCR分析显示突变株中IS1拷贝数显著增加，证实了 copy-and-paste（复制粘贴）型转座机制。野生株仅含2个IS1拷贝，而突变株中增至3个拷贝。

转座序列特征分析

插入的IS1元件全长768bp，两端具有26bp反向重复序列（IRs）。转座导致hsdM基因编码区出现9bp靶位点重复（TSDs），这是IS1转座的典型特征。

讨论

比较基因组学显示鲇鱼爱德华氏菌含29-39个IS1拷贝，而杀鱼爱德华氏菌多数菌株不含IS1。本研究中野生型NH1株含2个IS1拷贝，但在CRISPR/Cas9编辑过程中发生了IS1的复制型转座。值得注意的是，所有CRISPR/Cas9编辑株均在同一基因组位点（hsdM基因）发生IS1插入，表明该位点是IS1转座的热点区域。研究排除了sgRNA脱靶效应可能，因为sgRNA与转座区域无序列同源性。这种特异性转座现象可能与DNA断裂后的修复机制或局部染色质状态有关。

结论

本研究首次证实CRISPR/Cas9介导的基因组编辑会触发细菌IS元件的特异性转座，这一发现对细菌基因编辑技术的安全应用具有重要启示意义。需要进一步研究阐明IS1转座的具体分子机制及其对细菌适应性的影响。