利用CRISPR/Cas9系统敲除mstnb基因培育速生型草鱼

本研究针对草鱼传统育种方法难以进一步提升产量的问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除肌肉生长抑制素基因mstnb，成功获得F0代突变体。实验结果表明突变体体重增长18.0%，体长增加14.5%，肌肉纤维数量显著增加，为水产养殖提供了具有重要应用价值的遗传改良材料。

　　

作为世界上养殖产量最高的淡水鱼类，草鱼在中国水产养殖业中占据举足轻重的地位。2023年全球草鱼产量达到587万吨，其中中国是主要生产国。然而，传统的育种方法已接近其极限，难以进一步显著提升草鱼的生长性能。草鱼性成熟周期长达5年，通过传统育种方法培育新品种需要15-20年时间，这严重制约了遗传改良的进程。

肌肉生长抑制素（myostatin，mstn）是转化生长因子β（TGF-β）超家族成员，在脊椎动物中作为骨骼肌发育和生长的负调控因子发挥着关键作用。该基因通过抑制生肌通路关键基因myod1的转录来限制肌肉生长。在哺乳动物中，mstn基因敲除可导致著名的"双肌"表型，肌肉质量增加2-3倍。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术因其成本效益高、效率高、省时且易于靶向特定基因等优势，已成为水产养殖遗传育种的重要工具。

西南大学的研究团队针对草鱼生长性能提升的需求，开展了通过基因编辑技术培育速生型草鱼的研究。研究人员首先在草鱼中鉴定出两个mstn旁系同源基因——mstna和mstnb。通过组织分布分析发现，mstnb在肌肉组织中表达，而mstna仅在脑中表达，这表明mstnb可能参与草鱼肌肉生长的调控。

为了探究mstnb在骨骼肌生长中的作用，研究人员采用CRISPR/Cas9系统，通过共注射Cas9蛋白和sgRNA到单细胞期胚胎中来破坏mstnb基因。实验使用了约1100枚受精卵，最终850枚孵化并存活至幼鱼阶段。在4月龄时，研究人员随机选择了41尾鱼进行基因型分析，发现85.3%的个体在mstnb靶位点携带突变，包括各种移码 indel突变。

研究采用的主要技术方法包括：通过显微注射将Cas9蛋白和sgRNA导入单细胞期草鱼胚胎；使用T7E1 assay和Sanger测序进行突变检测；通过异源双链泳动分析（HMA）进行大规模筛选；采用实时定量PCR分析基因表达；通过组织学H&E染色分析肌肉表型。

研究结果方面，在系统发育分析和表达谱部分，研究人员构建了mstn氨基酸序列的系统发育树，发现鱼类Mstn蛋白分为Mstna和Mstnb两个明显不同的分支。共线性分析显示，硬骨鱼类中的mstnb是四足动物mstn的直系同源基因。RT-PCR分析显示mstna表达仅限于脑部，而mstnb在肌肉、脑、肝、肾和心脏中均有表达。

在mstnb基因敲除部分，研究人员选择了位于mstnb第一外显子的20bp序列（GGATCAGTACGATGTTCTGG）作为sgRNA靶点。通过T7E1 assay和Sanger测序证实了基因编辑的成功，TA克隆测序鉴定了各种indel突变，这些突变大多导致移码或提前终止密码子，可能产生截短的无功能Mstnb蛋白。

在mstnb缺陷促进草鱼肌肉生长部分，形态学分析显示，4月龄时mstnb F0突变体比野生型同胞鱼身体更厚更宽。具体数据显示，突变体体长增加14.5%，体重增加18.0%，体宽增加17.0%，体高增加14.8%。组织学分析发现，虽然单个肌纤维大小无显著差异，但突变体肌肉纤维总数显著增加。基因表达分析显示突变体中mstnb表达显著下调，而肌肉生长相关基因myod1和vegfba显著上调。

研究讨论部分指出，mstn作为骨骼肌生长负调控因子的功能在脊椎动物中已得到充分证实。本研究首次报道了通过破坏mstnb基因显著增强草鱼肌肉生长。与野生型同胞相比，草鱼F0突变体体重增加约18.0%，虽然表型增强比其他一些物种更为温和，但仍代表显著改进。值得注意的是，草鱼mstnb F0突变体未显示单个肌纤维大小的显著增加，而是表现出更高的肌肉纤维总数，表明体重增加主要源于肌肉增生而非肥大。这与在小鼠中观察到的既有肥大又有增生的情况不同，凸显了mstn调控肌生成的种间差异。

该研究的成功为草鱼遗传育种提供了宝贵的种质资源。通过基因编辑和雌核发育技术，基因编辑新品种可在5年内提供，相比传统育种方法的15-20年大大缩短了育种周期。mstnb突变体的产生不仅为理解mstnb调控肌肉生长的分子机制提供了新见解，也为水产养殖中生长性状的遗传改良提供了有应用前景的遗传材料。

研究人员总结道，他们在草鱼中鉴定出两个mstn旁系同源基因mstna和mstnb，其中mstnb在肌肉组织中优势表达。通过CRISPR/Cas9系统成功破坏mstnb基因并获得高突变效率的F0突变体。与野生型同胞相比，mstnb F0突变体体重和体长显著增加，这种生长增强表型主要源于肌肉纤维数量的增加而非纤维大小的增加。这些发现为mstnb在肌肉生长中的作用提供了新认识，为草鱼水产养殖的未来育种努力提供了宝贵种质。